微生态制剂改善鸡免疫功能的研究进展

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作者 毛立 袁方 +2 位作者 杨珊珊 廖洪 郭春艳 《中国动物保健》 2025年第4期211-213,共3页

肠道疾病是家禽养殖中的重要疾病,随着兽用抗菌药使用减量化,抗生素治疗肠道疾病的方法正在被替代,减抗限抗、全面提升畜禽绿色健康养殖水平成为禽类养殖重要目标。微生态制剂是优良的减抗替抗投入品,不产生耐药性、无休药期、不易产生... 肠道疾病是家禽养殖中的重要疾病,随着兽用抗菌药使用减量化,抗生素治疗肠道疾病的方法正在被替代,减抗限抗、全面提升畜禽绿色健康养殖水平成为禽类养殖重要目标。微生态制剂是优良的减抗替抗投入品,不产生耐药性、无休药期、不易产生毒副作用。本文总结了鸡肠道菌群的组成和功能、微生态制剂改善鸡免疫机能等方面的作用,提出了微生态制剂类新兽药目前存在的瓶颈,以期为微生态制剂类新兽药的研究和发展提供参考。 展开更多

关键词 微生态制剂 鸡 进展

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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白原核表达及ELISA方法建立 被引量：1

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作者 陈思宇 张梦洁 +12 位作者 田睿 陈益 刘镝钺 李文良 毛立 程子龙 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 杜改梅 储岳峰 王金泉 刘茂军 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期97-105,共9页

绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF... 绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF-Tu蛋白,以纯化的rEF-Tu为包被抗原,建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 kDa,与预期相符;Western blot证实具有良好的反应原性;建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示,包被抗原浓度为1.25 mg/L,37℃孵育2 h;封闭条件为30 g/L BSA,37℃孵育1 h;待检血清1∶100稀释,37℃孵育45 min;酶标二抗1∶20000稀释,37℃孵育30 min;底物TMB 37℃避光反应15 min;样品OD450值≥0.296时判定为阳性,OD450值≤0.265时判定为阴性,OD 450值0.265~0.296则判为可疑;组内和组间变异系数均低于10%;用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测,两者特异性为90.70%,敏感性为82.69%,符合率约为87.12%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性,为Mo的临床诊断、抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法,也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多

关键词 绵羊肺炎支原体 EF-Tu蛋白 原核表达 间接ELISA

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江苏某牛场犊牛呼吸道疾病原检测与牛支原体的分离鉴定分析

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作者 张洪菊 程子龙 +5 位作者 韦艳娜 毛立 刘茂军 牛家强 冯志新 李文良 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期52-60,共9页

为查明江苏某奶牛场一起犊牛呼吸道疾病的病因,采集发病牛鼻拭子30份,采用RT-PCR/PCR方法对主要病原进行检测。对病毒检测阳性样品进行测序和遗传进化分析。对牛支原体(M.bovis)阳性样本进行分离培养,进而进行生化实验、生长曲线测定、... 为查明江苏某奶牛场一起犊牛呼吸道疾病的病因,采集发病牛鼻拭子30份,采用RT-PCR/PCR方法对主要病原进行检测。对病毒检测阳性样品进行测序和遗传进化分析。对牛支原体(M.bovis)阳性样本进行分离培养,进而进行生化实验、生长曲线测定、药敏试验和遗传进化分析。结果显示:M.bovis(18份)、溶血性曼氏杆菌(1份)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)(2份)、牛冠状病毒(BCoV)(6份)为阳性,其他病原均为阴性;3株M.bovis生长曲线一致,不发酵葡萄糖、甘露醇,不水解明胶、七叶苷,不分解尿素;3株M.bovis均对泰妙菌素、林可霉素和泰万菌素敏感;序列分析表明,3株M.bovis oppF基因序列与各参考株的同源性为98.6%~100%,与国内菌株亲缘关系近,该牛场流行BVDV毒株为BVDV-1a亚型,BCoV毒株属于GIIb亚型。结果表明,该病例主要由M.bovis引起,伴发BCoV和BVDV,可优先选用泰妙菌素、林可霉素、泰万菌素进行防控,同时应加强病毒性病原的监测与防控。 展开更多

关键词 牛 呼吸道病 牛支原体 分离鉴定 药敏试验 进化分析

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经典和重组兔黏液瘤病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

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作者 周雅楠 陈萌萌 +8 位作者 仇汝龙 魏后军 范志宇 胡波 宋艳华 葛雷 李一鸣 徐为中 王芳 《江苏农业科学》 北大核心 2025年第1期226-230,共5页

根据GenBank已登录的经典兔黏液瘤病毒(MYXV)和重组兔黏液瘤病毒(ha-MYXV)基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立能同时检出ha-MYXV和MYXV病原的快速、简单且敏感性较高的TaqMan探针荧光定量PCR临床检测方法。结果显示,稀释度为1... 根据GenBank已登录的经典兔黏液瘤病毒(MYXV)和重组兔黏液瘤病毒(ha-MYXV)基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立能同时检出ha-MYXV和MYXV病原的快速、简单且敏感性较高的TaqMan探针荧光定量PCR临床检测方法。结果显示,稀释度为1×10^(7)~1×10^(3)拷贝/μL标准品建立的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为1.00;该方法对MYXV和ha-MYXV具有高度特异性,与绿脓杆菌、兔多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、兔出血症病毒1型、兔出血症病毒2型等其他病原间无交叉反应;检测灵敏度可达1×10^(2)拷贝/μL;组内和组间变异系数在0.05%~1.19%间。该方法的建立为引进种兔及家兔相关产品兔黏液瘤病毒的检疫提供了技术支撑。 展开更多

关键词 兔黏液瘤病 经典兔黏液瘤病毒 重组兔黏液瘤病毒 TaqManqPCR

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G1P[7]型猪轮状病毒的分离鉴定及其全基因组分析

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作者 王建新 马润超 +5 位作者 周金柱 卞贤宇 朱雪蛟 李昱辰 张雪寒 李彬 《南方农业学报》 北大核心 2025年第3期932-943,共12页

[目的]分离鉴定G1P[7]型猪轮状病毒(PoRV)并进行全基因组分析,为仔猪腹泻病防控及疫苗研发提供理论依据。[方法]腹泻仔猪粪便样本由南京农业大学动物医学院提供,对样本进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔... [目的]分离鉴定G1P[7]型猪轮状病毒(PoRV)并进行全基因组分析,为仔猪腹泻病防控及疫苗研发提供理论依据。[方法]腹泻仔猪粪便样本由南京农业大学动物医学院提供,对样本进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及PoRV PCR检测。向PCR检测结果为阳性的样本上清液中加入胰蛋白酶,随后接种到MA104细胞进行病毒分离和纯化。通过PCR检测、电镜观察、间接免疫荧光检测和RAN-PAGE检测鉴定毒株。通过绘制病毒增殖曲线和检测病毒对MA104、Vero、IPEC-J2、HT-29、HRT-18和Caco-2细胞的易感性探究毒株生物学特性。利用生物信息学软件分析分离毒株的11个基因与国内外各基因型轮状病毒的同源性并构建病毒全基因组系统发育树。[结果]粪便样本PCR检测结果显示,粪便样本中仅PoRV呈阳性。成功分离出1株PoRV,将该毒株命名为JSNJ2023,病毒在MA104细胞上能稳定增殖和传代,经3次克隆,筛选出适合的克隆株,在第3次克隆中,选择病毒滴度最高的克隆株进行扩大培养,最终成功获得高滴度的单克隆毒株。病毒颗粒呈明显的球形结构,具有清晰的双层衣壳特征,直径约70 nm。间接免疫荧光检测结果显示,JSNJ2023毒株能感染MA104细胞。RNA-PAGE检测结果显示,JSNJ2023毒株具有A群轮状病毒特征性的11条电泳图谱,排列方式为4∶2∶3∶2。病毒增殖曲线显示,接种病毒18 h后JSNJ2023毒株在MA104细胞中的病毒滴度达峰值,随着感染时间的延长,病毒滴度逐渐降低。JSNJ2023毒株对细胞的易感性依次为MA104、IPEC-J2、HRT-18、HT-29、Caco2和Vero细胞。基因同源性分析与系统发育树构建结果显示,JSNJ2023毒株属于猪A群G1P[7]型轮状病毒,其基因型为G1-P[7]-I5。[结论]成功分离获得PoRV JSNJ2023毒株,其属于A群G1P[7]型轮状病毒,基因型为G1-P[7]-I5。JSNJ2023毒株与人、猪及牛轮状病毒存在高度同源性,其进化过程中可能受到人轮状病毒、PoRV与牛轮状病毒的影响,发生了基因重组或交换,形成了独特的基因型(R1-C1-M1-A8-N1-T7-E1-H1)。 展开更多

关键词 猪轮状病毒(PoRV) 全基因组测序 遗传进化分析 基因重组

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一株羊冠状病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

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作者 余秋蓉 蔡旭航 +4 位作者 何艺 李基棕 毛立 许信刚 李彬 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第9期4604-4614,共11页

冠状病毒在全世界广泛流行,能够引起人和动物呼吸道和消化道疾病,动物感染冠状病毒对养殖业造成巨大经济损失。为进一步丰富我国草食动物冠状病毒的流行病学资料,笔者拟对新疆腹泻山羊样品进行羊冠状病毒(caprine coronavirus,cpCoV)分... 冠状病毒在全世界广泛流行,能够引起人和动物呼吸道和消化道疾病,动物感染冠状病毒对养殖业造成巨大经济损失。为进一步丰富我国草食动物冠状病毒的流行病学资料,笔者拟对新疆腹泻山羊样品进行羊冠状病毒(caprine coronavirus,cpCoV)分离研究,并开展生物学特性鉴定。用RT-PCR方法从新疆昌吉某羊场腹泻山羊肛拭子样品中检测到cpCoV阳性,成功分离一株羊冠状病毒,命名为cpCoV/XJCJ2301G。该毒株接种细胞后可观察到明显的细胞病变,IFA试验、RT-PCR检测均为cpCoV阳性,电镜观察可见直径100 nm,周围呈皇冠状的特异病毒颗粒。病毒的遗传演化结果表明,XJCJ2301G株处于β-CoVs Embecovirus分支,与现有羊冠状病毒共同组成独立进化分支,独立于牛冠状病毒的四个亚型。经分析NS4a-NS4b基因序列,发现在两段区域内有75 nt缺失突变,导致非结构蛋白截短或延长。S基因序列比对分析发现,cpCoV与BCoV的差异主要集中于CTD区域。本研究首次从新疆地区分离到的羊冠状病毒,丰富了我国冠状病毒的流行病学资料,其NS4a-NS4b碱基数量在牛、羊和兔冠状病毒之间形成阶梯式依次缺失,提示该毒株可能是动物冠状病毒演化过程中的节点,在草食动物冠状病毒的遗传演化过程中具有重要意义。 展开更多

关键词 羊冠状病毒 分离鉴定 全基因组测序 进化分析

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TGEV SHXB株组织毒对1月龄仔猪的致病性研究

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作者 肖丽 张宝太 +8 位作者 蔡旭航 李思远 朱雪蛟 郭荣利 查银河 舒建洪 主性 李基棕 李彬 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期56-61,共6页

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染哺乳仔猪可出现剧烈呕吐、水样腹泻、脱水和死亡,随着仔猪日龄增加,发病则较为温和,但TGEV对1月龄仔猪是否有致病性尚无人报道。本试验旨在评估TGEV SHXB株组织毒对1月龄仔猪的致病性。将5头5日龄仔猪分为... 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染哺乳仔猪可出现剧烈呕吐、水样腹泻、脱水和死亡,随着仔猪日龄增加,发病则较为温和,但TGEV对1月龄仔猪是否有致病性尚无人报道。本试验旨在评估TGEV SHXB株组织毒对1月龄仔猪的致病性。将5头5日龄仔猪分为两组,第一组口服TGEV SHXB病毒液,攻毒剂量为2 mL×10^(5.0)TCID_(50)/头,第2组仔猪口服2 mL的DMEM。病毒载量最高时剖杀,取其肠道研磨获取组织毒。将8头1月龄仔猪分为两组,第一组1月龄仔猪口服TGEV SHXB组织毒,攻毒剂量为10 mL×10^(6.50)copies/mL,第二组口服10 mL的DMEM。攻毒后每天采集肛拭子样品,荧光定量检测试验猪排毒情况,并记录观察仔猪腹泻情况,7 d后全部剖杀,观察肠道及其他脏器变化情况,取十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠做病理切片和免疫组化。结果显示TGEV SHXB对5日龄仔猪具有较高的致病性,且5日龄发病小猪的肠道内容物能感染1月龄仔猪,攻毒猪在3 DPC左右出现水样腹泻,检测到持续排毒,在4 DPC排毒量最高(约10^(8.0)copies/mL);剖检可见肠腔扩张、肠壁变薄充血和肠系膜充血等;攻毒猪组织病理学检查,可见小肠绒毛严重萎缩、脱落并伴有炎性细胞浸润。免疫组化结果显示,攻毒猪十二指肠、空肠和回肠绒毛上皮细胞胞中检测到TGEV阳性颗粒。本研究首次揭示了TGEV SHXB组织毒对1月龄仔猪具有较强的致病性,为TGEV的仔猪攻毒模型研究提供新的参考。 展开更多

关键词 TGEV SHXB 组织毒 致病性 1月龄仔猪

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乙肝核心抗原嵌合PEDV S1抗原表位病毒样颗粒疫苗的免疫原性评价

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作者 赵淑庆 张宝太 +8 位作者 刘孟冉 薛涛 钟纯燕 周金柱 刘传敏 主性 倪艳秀 李基棕 李彬 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期36-41,共6页

为了构建以乙肝核心抗原(HBcAg)为载体呈现PEDV S1抗原表位的病毒样颗粒并评价其免疫原性。本研究以HBcAg作为免疫原载体,将PEDV S1中的B细胞表位748YSNIGVCK755插入HBcAg的主要免疫显性区域(MIR),克隆至pET-28a(+)载体,转化至大肠杆菌B... 为了构建以乙肝核心抗原(HBcAg)为载体呈现PEDV S1抗原表位的病毒样颗粒并评价其免疫原性。本研究以HBcAg作为免疫原载体,将PEDV S1中的B细胞表位748YSNIGVCK755插入HBcAg的主要免疫显性区域(MIR),克隆至pET-28a(+)载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,IPTG进行诱导表达后,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定纯化后的重组蛋白,通过透射电镜检测其形态学,制备疫苗皮下注射免疫BALB/c小鼠,对其免疫效果进行了初步评价。结果表明,成功构建重组质粒PET-28a(+)-HBcAg-PEDV S1,并在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,纯化、复性后的重组蛋白透射电子显微镜观察到病毒样颗粒结构。制备的疫苗能诱导小鼠产生较高水平的抗体和中和抗体。上述研究表明,本研究构建的HBcAg-PEDV S1能组装成病毒样颗粒,免疫原性较强,具有成为新型候选疫苗的潜力。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻 乙肝核心抗原 病毒样颗粒 免疫原性

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单核细胞趋化蛋白诱导蛋白3对猪流行性腹泻病毒复制的体外抑制作用

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作者 周洪婷 孙心如 +6 位作者 范宝超 张雪寒 周金柱 索朗斯珠 孙敏 贡嘎 李彬 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2847-2856,共10页

旨在探究单核细胞趋化蛋白诱导蛋白3(monocyte chemotactic protein-induced protein 3,MCPIP3)对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)复制的影响。通过RT-qPCR测定PEDV感染后ZC 3H12C转录水平的动态变化;进而以猴... 旨在探究单核细胞趋化蛋白诱导蛋白3(monocyte chemotactic protein-induced protein 3,MCPIP3)对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)复制的影响。通过RT-qPCR测定PEDV感染后ZC 3H12C转录水平的动态变化;进而以猴肾上皮细胞cDNA为模板,PCR扩增出ZC 3H12C基因,克隆到P3×Flag-CMV-14真核表达载体上,构建MCPIP3蛋白表达真核重组载体;分别于非洲绿猴胚胎肾细胞(MARC-145)上过表达或干扰MCPIP3蛋白,通过Western blot、荧光定量PCR、病毒滴度测定等方法探究其对PEDV复制的影响。结果表明,PEDV感染MARC-145细胞后显著上调ZC 3H12C转录水平;成功构建MCPIP3重组质粒,其转染细胞后可诱导MCPIP3蛋白外源高表达,且特异性siRNA可显著下调ZC 3H12C转录水平;与对照组相比,MCPIP3高表达后显著抑制PEDV N蛋白的表达水平,下调PEDV N基因的转录水平及细胞上清内病毒滴度,而干扰MCPIP3表达具有相反的效应,说明MCPIP3对PEDV在MARC-145细胞中的增殖具有显著抑制作用;同时,MCPIP3高表达显著下调PEDV感染诱导的IL-8、IL-12β及TNF-α的转录水平。本研究拓展了MCPIP3蛋白的功能研究,为PEDV复制机制研究提供了理论基础。 展开更多

关键词 MCPIP3 PEDV 病毒复制 抗病毒作用

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藏猪产色葡萄球菌分离鉴定及生物学特性研究 被引量：7

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作者 赵霞玲 肖琦 +5 位作者 钱雯娴 温东旭 严明帅 吕立新 牛家强 何孔旺 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第9期3014-3021,共8页

为了解西藏林芝市健康藏猪的葡萄球菌感染情况,对从西藏林芝市工布江达县巴河镇屠宰场、林芝市巴宜区西藏农牧学院教学实习牧场、林芝市巴宜区屠宰场采集的232份样品进行了细菌分离培养与鉴定,并对1株分离菌株进行了较为系统的生物学特... 为了解西藏林芝市健康藏猪的葡萄球菌感染情况,对从西藏林芝市工布江达县巴河镇屠宰场、林芝市巴宜区西藏农牧学院教学实习牧场、林芝市巴宜区屠宰场采集的232份样品进行了细菌分离培养与鉴定,并对1株分离菌株进行了较为系统的生物学特性研究。流行病学调查结果显示,在232份样品中,共检出73份葡萄球菌阳性,阳性率为31.47%,其中在西藏林芝工布江达县巴河镇屠宰场检出16份阳性,检出率为23.89%(16/67);林芝市巴宜区西藏农牧学院牧场检出43份阳性,检出率为34.40%(43/125);林芝市巴宜区屠宰场检出14份阳性,检出率为35.00%(14/40);分离菌经PCR鉴定、基因测序、生化鉴定,证明分离到5株产色葡萄球菌,对其中一株(Sa LZ1)进行了系统的研究。Sa LZ1菌株在琼脂培养基上形成圆形凸起、边缘整齐、表面光滑、不透明的瓷白色菌落,革兰氏染色为阳性球菌;PCR测序结果显示,分离株与产色葡萄球菌(GenBank登录号:MG576253.1)同源性最高;生化鉴定结果显示,其对血清菊糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖等表现为阳性,对阿拉伯糖、马尿酸钠、棉子糖、木糖、尿素等表现为阴性,符合产色葡萄球菌的生化特性;Sa LZ1在接种后5~10 h处于对数生长期;小鼠致病性试验显示,当Sa LZ1菌株攻毒浓度达3.5×10^9 CFU/mL时小鼠死亡率达100%,且病理切片结果表明,Sa LZ1菌株能引起小鼠内脏组织发生病变。以上结果为西藏林芝市藏猪葡萄球菌的防控提供理论依据。 展开更多

关键词 藏猪 检菌率 产色葡萄球菌 分离鉴定 生物学特性

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仔猪腹泻病流行现状及防控技术研究进展 被引量：5

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作者 刘诗雨 李彬 《广东畜牧兽医科技》 2023年第3期1-7,共7页

仔猪腹泻病在猪群中发病急、规模大、速度快,年平均发病率高,给全球养猪业带来巨大威胁,导致惨重的经济损失。仔猪腹泻病病因复杂,引起仔猪腹泻的主要病原具有能自然重组、持续变异、宿主谱广和血清型多样等流行特征。随着变异病原增多... 仔猪腹泻病在猪群中发病急、规模大、速度快,年平均发病率高,给全球养猪业带来巨大威胁,导致惨重的经济损失。仔猪腹泻病病因复杂,引起仔猪腹泻的主要病原具有能自然重组、持续变异、宿主谱广和血清型多样等流行特征。随着变异病原增多、混合感染情况严重及疫苗保护效果下降等问题的出现,迫切需要开发更灵敏准确的检测手段、更安全有效的可用疫苗和升级现有的综合防控技术。该文就仔猪腹泻病的病因、流行现状和综合防控关键技术研究进展方面进行阐述总结,提出疫病精准诊断、疫苗合理选择、加强生物安全和严格饲养管理等的综合防控措施,为诊断和防控该病提供参考依据。 展开更多

关键词 仔猪腹泻病 病毒性腹泻 流行现状 疫苗 综合防控

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绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立 被引量：4

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作者 杜改梅 王月 +3 位作者 茅慧华 雷卫强 储岳峰 刘茂军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1728-1737,共10页

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μ... 旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05);感染第13天,感染组2和组4小鼠出现死亡;感染后第14天剖检,Mo感染组2和组4小鼠肺部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),而对照组小鼠无病变;组织病理学检查发现,Mo感染组小鼠肺可见不同程度的间质性肺炎,肺泡腔内有炎细胞浸润;对照组小鼠肺组织结构正常、完整,肺泡内未见明显细胞浸润。小鼠肺组织中Mo DNA拷贝数在Mo感染组1和组3中分别为10^(2.56)和10^(3.21)拷贝·g^(-1);感染组2和组4分别为10^(3.84)和10^(3.77)拷贝·g^(-1),且显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),对照组为阴性。小鼠血清Mo抗体OD_(450 nm)值在Mo感染组1、组2、组3和组4分别为0.63、1.05、0.81和0.99,均显著高于对照组(P<0.05),且组2和组4均显著高于1组(P<0.05)。本研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究奠定基础。 展开更多

关键词 绵羊肺炎支原体 小鼠 感染模型

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非洲猪瘟病毒p30蛋白氨基酸序列分段表达及反应原性分析

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作者 周俊明 倪艳秀 +5 位作者 范宝超 祝昊丹 朱雪蛟 王丹丹 胡屹屹 李彬 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第10期1875-1881,共7页

为比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性,探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a,... 为比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性,探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a,经IPTG诱导、Ni柱纯化、透析后,获得p30蛋白氨基酸序列中8~101 aa片段(P-1#)、58~101 aa片段(P-2#)、101~158 aa片段(P-3#)、8~194 aa片段(P-4#),用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析p30蛋白氨基酸序列中不同片段与p30蛋白免疫兔血清和ASFV阳性猪血清的反应原性。结果显示,上述片段均获得诱导表达及纯化,表达形式有可溶性表达(P-1#、P-3#)和包涵体表达(P-2#、P-4#)。各片段以1.0 mg/L包被时,p30免疫兔血清与p30蛋白氨基酸序列中4种片段均能发生免疫反应,ASFV阳性猪血清与P-4#、P-1#反应较佳,与P-3#反应中等,与P-2#反应最弱。综上,p30蛋白氨基酸序列中不同片段反应原性的差异为认识p30抗原优势区域提供了数据,这将有助于非洲猪瘟血清学诊断抗原的科学筛选。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 氨基酸序列片段 反应原性

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新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物种感染中的作用

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作者 毕振威 王文杰 +1 位作者 刘雅坤 彭大新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期660-669,共10页

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及... 物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。 展开更多

关键词 A型流感病毒(IAV) 犬酸性核磷蛋白32A(caANP32A) RNA聚合酶活性 哺乳动物适应性

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河北省廊坊市牛主要病毒性腹泻病原感染状况检测及牛冠状病毒演化分析 被引量：3

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作者 李思远 付新成 +10 位作者 袁雪松 毛立 蔡旭航 孙心如 黄金 谢玲玲 王府 周华 张琪 李基棕 李彬 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期649-659,共11页

牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还... 牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还会导致母牛生殖功能异常,这些疾病对畜牧业造成巨大的经济损失。为了解牛主要病毒性腹泻病原流行情况,本次试验通过PCR检测方法对我国河北地区323份腹泻牛粪样品进行常见9种病毒性牛腹泻病原进行检测。结果显示,BVDV阳性检出率1.85%(6/323)、BCoV阳性检出率14.24%(46/323)、BRV阳性检出率57.89%(187/323)、BoAstV阳性检出率0.31%(1/323)、BoNeV阳性检出率10.84%(35/323)、BNoV阳性检出率4.33%(14/323)、MRV阳性检出率2.48%(8/323)、BToV阳性检出率4.64%(15/323)、BKoV阳性检出率11.76%(38/323)。混合感染共有76份,占比23.53%(76/323)。HBLF2302株的全基因序列、S、HE、N、M和E基因进行同源性和遗传进化分析发现,HBLF2302与BCoV/NMG1/2022基因同源性最高,为GIIb亚型。基于氨基酸序列比对和HBLF2302的S蛋白三级结构预测发现,在S蛋白中157号位突变为157T,854号位点突变为854I。318V为独特突变,改变了与侧链残基的作用力,与631C形成氢键连接。并发现中国株区别于其它地区的GⅡb亚型,位于ORF1a区域有三个独特位点。本研究丰富了牛腹泻病原的流行病学数据,为牛腹泻病的防控奠定基础。 展开更多

关键词 病毒性腹泻 牛冠状病毒 流行病学调查 腹泻病原

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牛冠状病毒S1蛋白的真核表达及间接ELISA方法的建立与应用 被引量：1

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作者 黄金 李思远 +6 位作者 毛立 蔡旭航 谢玲玲 王府 周华 李基棕 李彬 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2050-2060,共11页

为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫Hi... 为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫High5细胞培养基上清,经Western blot鉴定S1蛋白抗原性良好;经反应条件优化,确定抗原包被浓度为0.125μg·mL^(-1),血清稀释度为1∶200;采用1%明胶,于37℃封闭3 h;血清样品于37℃孵育30 min;酶标二抗的稀释度1∶25000,37℃孵育45 min;37℃避光显色13 min;临界值为0.297;经检验,该方法特异性良好;批间及批内变异系数均小于10%。当临界值为OD_(450 nm)为0.297时,若以IFA为标准,ELISA的敏感性为96.88%(31/32),特异性为87.50%(7/8),与IFA具有很强的一致性(κ=0.844,P<0.01);若以中和试验为标准,ELISA的敏感性为100.00%(31/31),特异性为88.89%(8/9),与血清中和试验具有很强的一致性(κ=0.925,P<0.01)。采用该方法对303份牛血清进行检测,BCoV阳性率为74.91%。由此说明,本研究建立的ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于BCoV的血清学调查和临床诊断,并可以应用于替代中和试验检测BCoV免疫后抗体水平。 展开更多

关键词 牛冠状病毒 昆虫杆状病毒表达系统 S1蛋白 间接ELISA

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绵羊源哺乳动物正呼肠孤病毒的分离鉴定及全基因组分析

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作者 李霞 何艺 +5 位作者 蔡旭航 罗润波 郭容利 索朗斯珠 毛立 李彬 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5641-5650,共10页

为了解绵羊源哺乳动物正呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)的生物学特性及全基因组特征,本研究从绵羊腹泻病料中分离了一株MRV,命名为MRV-XJ23株,经RT-PCR、电镜观察和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定后,扩增病毒全基因组进行同源性... 为了解绵羊源哺乳动物正呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)的生物学特性及全基因组特征,本研究从绵羊腹泻病料中分离了一株MRV,命名为MRV-XJ23株,经RT-PCR、电镜观察和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定后,扩增病毒全基因组进行同源性及遗传进化分析。研究结果表明,MRV-XJ23分离株可在MDBK细胞稳定传代,产生特异的细胞病变,病毒滴度为10^(6)TCID_(50)·mL^(-1)。MRV感染细胞经IFA检测可观察到特异荧光,电镜可观察到直径约70 nm的无囊膜病毒粒子。经RT-PCR扩增和测序获得MRV全基因组,该毒株共10个节段,全长23534 bp。序列对比及遗传进化分析结果显示,MRV-XJ23株为MRV-1血清型,其在韩国蝙蝠源BatMRV2/SNU1/Korea/2021毒株基础上,与日本的人源Homo sapiens/Osaka2005株L3、M2、S 4基因、印度牛源C/bovine/Indiana/MRV00304/2014株S 1基因重配,形成一株新的MRV。本研究首次从腹泻绵羊肛拭子中分离获得一株MRV-1型重配毒株,证明绵羊可感染MRV,拓宽了病毒感染宿主谱,且感染毒株为蝙蝠源、人源和牛源MRV重配毒株,证明这些毒株跨物种感染后发生了复杂的重配。本研究揭示了MRV在各物种中循环传播对公共卫生的风险,提升了深入研究MRV在绵羊乃至家畜中的流行病学、重配规律和致病性的重要性。 展开更多

关键词 哺乳动物正呼肠孤病毒 绵羊 分离鉴定 重配 进化分析

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犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

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作者 王卓 徐司雨 +8 位作者 夏兴霞 李志敏 毕振威 钱晶 莫菲 诸玉梅 王永山 孙树民 谭业平 《中国兽药杂志》 2024年第5期10-16,共7页

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9... 为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。 展开更多

关键词 犬 PD-1 单克隆抗体 肿瘤

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多杀性巴氏杆菌OmpH2对宿主Fn和Plg黏附作用的研究 被引量：5

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作者 陈露 朱伟峰 +5 位作者 魏后军 仇汝龙 胡波 范志宇 陈萌萌 王芳 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第6期10-15,共6页

多杀性巴氏杆菌是危害多种畜禽和野生动物的重要病原并可造成人类发病。OmpH(包括OmpH1和OmpH2)是巴氏杆菌细胞壁中的一种主要外膜蛋白,过去对OmpH致病作用的研究主要集中于OmpH1,而有关OmpH2的报道较少。本研究对OmpH1和OmpH2一级结构... 多杀性巴氏杆菌是危害多种畜禽和野生动物的重要病原并可造成人类发病。OmpH(包括OmpH1和OmpH2)是巴氏杆菌细胞壁中的一种主要外膜蛋白,过去对OmpH致病作用的研究主要集中于OmpH1,而有关OmpH2的报道较少。本研究对OmpH1和OmpH2一级结构进行了比较,发现OmpH2一级结构上具有多个与OmpH1高度相似的局部区域。采用原核表达系统表达了rOmpH2,进而开展了Western blot、Far Western blot和招募抑制实验。OmpH2与巴氏杆菌感染康复血清发生了特异性反应。OmpH2能够结合宿主Fn和Plg,而且OmpH2多克隆抗体能够显著抑制多杀性巴氏杆菌对Fn和Plg的黏附。本研究表明OmpH2能够在多杀性巴氏杆菌结合宿主Fn和Plg的过程中发挥作用,增加了多杀性巴氏杆菌毒力因子和分子致病机制的认识,对巴氏杆菌病防控具有重要意义。 展开更多

关键词 多杀性巴氏杆菌 OmpH2 纤维连接蛋白 血浆纤维溶解酶原

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鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定 被引量：2

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作者 赵冬敏 韩凯凯 +7 位作者 刘青涛 黄欣梅 杨婧 刘宇卓 章丽娇 田宇杰 王梦瑶 李银 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期173-178,共6页

【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅... 【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用。【结果】DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70)。含重组质粒pET32aHSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应。以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染。【结论】HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计。 展开更多

关键词 坦布苏病毒 鸭胚成纤维细胞 热休克蛋白70 受体 免疫共沉淀 病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)

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