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G57基因型H9N2亚型禽流感病毒反向遗传系统的建立与验证
1
作者 史玉婷 韩心雨 +5 位作者 钟沐卉 林耀忠 柳腾飞 李焰 尹会方 贾伟新 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第4期1825-1833,共9页
旨在构建当前流行毒株H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)的反向遗传操作平台。毒株A/Chicken/Guangdong/M/2021(H9N2)(简称为M)分离自广东某养鸡场病料。鉴定并分析其全基因组序列,通过RT-PCR以及无缝克隆技术完成质粒构... 旨在构建当前流行毒株H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)的反向遗传操作平台。毒株A/Chicken/Guangdong/M/2021(H9N2)(简称为M)分离自广东某养鸡场病料。鉴定并分析其全基因组序列,通过RT-PCR以及无缝克隆技术完成质粒构建,共转染293T细胞成功拯救毒株命名为rM。测定病毒的稳定性和生长曲线;进行动物试验,从传播效率、致病性角度验证克隆毒株与原毒的一致性。结果显示:M毒株为G57基因型,为近年的流行毒株。M毒株与rM毒株在酸稳定性、热稳定性、致病性以及传播性等方面保持一致的生物学特性。综上,成功建立了G57基因型H9N2亚型AIV的反向遗传系统,且从体内和体外试验两个方面全面验证M与rM的生物学特性保持一致。 展开更多
关键词 反向遗传 H9N2 禽流感病毒 G57基因型
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱毒方法研究进展 被引量：4
2
作者 林如琴 吴思婷 +3 位作者 余丹妮 刘思 邓诣群 文继开 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2023年第6期90-99,共10页
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是粮食和饲料中污染广泛的真菌毒素之一,其化学性质稳定,毒性强,严重威胁人类和动物的健康。目前DON脱毒方法主要有物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法,其中生物脱毒法具有安全环保、特异性强... 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是粮食和饲料中污染广泛的真菌毒素之一,其化学性质稳定,毒性强,严重威胁人类和动物的健康。目前DON脱毒方法主要有物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法,其中生物脱毒法具有安全环保、特异性强、解毒效果显著等优点而备受推崇。生物脱毒法主要包括微生物的吸附作用和酶降解方式等。微生物的酶降解作用是通过破坏DON的毒性基团,例如C12,13位脱环氧、C3-OH氧化和C3-OH异构化等,将DON代谢转化为毒性较小甚至无毒的物质。某些种类的乳酸菌、芽孢杆菌、德沃斯氏菌和酵母菌等细菌和真菌都具备降解DON的能力,乳酸菌作为食品级的益生菌,在降解DON和防控食品真菌毒素污染具有广阔的应用前景。本文综述了DON脱毒方法的研究进展,将其优缺点进行分析总结,旨在为防控食品和饲料中DON污染,尤其是微生物对DON脱毒作用的进一步拓展和深入研究提供参考。 展开更多
关键词 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 脱毒技术 生物脱毒 脱毒微生物
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玉米赤霉烯酮在动物体内的代谢与分子毒性研究进展 被引量：4
3
作者 邓子锋 王利娟 +3 位作者 吴希强 杨宏辉 李廷元 汪玲玲 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期5194-5203,共10页
玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)是由镰刀属真菌产生的真菌毒素,广泛存在于霉变玉米、小麦、大麦等谷物中。ZEA在动物体内经代谢转化后随血液循环分布至全身,通过雌激素效应、氧化损伤和细胞凋亡等途径引发肝脏、肾脏、子宫、睾丸等器官... 玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)是由镰刀属真菌产生的真菌毒素,广泛存在于霉变玉米、小麦、大麦等谷物中。ZEA在动物体内经代谢转化后随血液循环分布至全身,通过雌激素效应、氧化损伤和细胞凋亡等途径引发肝脏、肾脏、子宫、睾丸等器官病变。近年来受气候、贮存设施等多种因素的影响,中国粮食作物中ZEA污染问题尤为突出,不仅给畜牧养殖和饲料产业带来严重困扰,而且也威胁人类健康。深入了解ZEA在动物体内的代谢过程及其发挥毒性的分子机制,对于制定防控新策略、降低毒素污染带来的负面影响尤为重要。作者着重从ZEA的吸收分布、代谢转化和分子毒理等方面对近年来的相关研究做了系统整理与归纳。 展开更多
关键词 玉米赤霉烯酮 代谢转化 分子毒性
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非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立 被引量：5
4
作者 徐玲玉 曹琛福 +4 位作者 李中圣 陈俊宏 柳腾飞 王新凯 贾伟新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期813-821,共9页
旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法。采用原核表达的ASFV p54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性... 旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法。采用原核表达的ASFV p54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价。结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0μg·mL^(-1),抗原包被温度及时间为4℃过夜,被检血清稀释度为1∶40,酶标单抗稀释度为1∶1000,被检血清作用时间为1 h,酶标单抗作用时间为30 min,底物作用时间为10 min。经阴、阳性样品检测和特异性、敏感性试验,当临界值阻断率≥55.2%时,判定为阳性,当阻断率<43.4%时,判定为阴性,介于两者之间判定为可疑。该方法与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、猪流感病毒、猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应,特异性好。批内重复试验及批间重复试验的变异系数(CV)均在10%以内。将该方法进行初步应用,并与商品化ELISA试剂盒进行符合性试验,两者的检测符合率为98%。综上表明,建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV临床样品的抗体检测。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 ASFV 阻断ELISA p54蛋白 单克隆抗体
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基于RT-RAA的禽流感H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法的建立 被引量：2
5
作者 杨芷翊 王新凯 +4 位作者 史玉婷 付思源 张钰炘 曹琛福 贾伟新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3803-3811,共9页
采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统,建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列,选取保守... 采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统,建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列,选取保守性区域设计具有强特异性的CRISPR RNA(crRNA)序列以及RT-RAA引物,并对检测体系中的主要成分LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix含量进行优化,建立了基于RT-RAA的AIV H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法。取105~1 copies·μL^(-1)含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明,本文设计的RT-RAA引物与crRNA特异且灵敏,其最佳反应体系中主要成分用量分别为LwaCas13a蛋白(60μg·mL^(-1))2.0μL、crRNA(100μmol·L^(-1))3.2μL、TaqMan探针(50μmol·L^(-1))1.28μL、T7 RNA Polymerase 0.25μL、NTP Buffer Mix 2.0μL。该方法检测灵敏度可达1 copy·μL^(-1),且与AIV H3、H6、H7、H9、H10亚型以及NDV、IBV、IBDV、DTMUV无交叉反应。对56份已知的临床样品进行检测,检测结果与荧光定量RT-PCR符合率为98.2%。综上,本研究通过RT-RAA等温扩增技术结合CRISPR-Cas13a基因编辑技术建立了针对AIV H5亚型的快速检测平台,该方法从样本的核酸抽提到获得检测结果的时间控制在1 h 20 min以内,为AIV H5亚型高灵敏度和高特异性的临床快速检测提供了新的技术手段,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 H5亚型禽流感病毒 CRISPR 等温扩增 核酸检测
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非洲猪瘟病毒CD2v胞内区蛋白间接ELISA方法的建立及初步应用 被引量：2
6
作者 王新凯 杨芷翊 +4 位作者 周华亮 唐金明 黄超华 曹琛福 贾伟新 《中国动物检疫》 CAS 2023年第3期97-104,共8页
近年来,在全球范围内出现了EP402R基因(编码CD2v蛋白)缺失的ASFV突变毒株,因此需要开发一种检测方法来区分CD2v缺失的自然突变株和野生型ASFV毒株。对ASFV国内分离株WUHAN 2019-1株的EP402R基因序列,利用生物信息学分析其亲水性,选取可... 近年来,在全球范围内出现了EP402R基因(编码CD2v蛋白)缺失的ASFV突变毒株,因此需要开发一种检测方法来区分CD2v缺失的自然突变株和野生型ASFV毒株。对ASFV国内分离株WUHAN 2019-1株的EP402R基因序列,利用生物信息学分析其亲水性,选取可溶性较强部分(232~333 aa),根据大肠杆菌密码子偏嗜性对该段基因进行优化并人工合成,插入原核表达载体pET-28a进行低温表达,获得带有HIS标签的可溶性CD2v胞内区重组蛋白,将其命名为pET-28a-CD2v-IS,大小约15 ku。Western-blot鉴定结果显示,该重组蛋白抗原性良好。利用纯化后的CD2v重组蛋白建立了间接ELISA方法。经反应条件优化,最终确定最佳包被质量浓度为0.5μg/mL,封闭时间为1 h,样本最佳稀释度为1:10,样本最佳孵育时间为1 h,二抗最佳稀释度为1:20000,最佳孵育时间为45 min,底物孵育最佳时间为5 min;确定建立的间接ELISA方法的S/N临界判定值为1.61。试验灵敏性可达1:1280;批内变异系数小于4.15%,批间变异系数小于9.84%;只与ASFV全病毒株阳性血清发生反应,与ASFV(CD2v)缺失株、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等其他病毒阳性血清均无交叉反应;在检测46份背景清晰与54份背景未知的血清时,与商用试剂盒符合率分别达到100%与90.7%。结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性与重复性,检测结果与商品化试剂盒和WOAH推荐的间接ELISA方法一致,如果结合其他ASFV结构蛋白制成的ELISA检测试剂盒,可区分ASFV野毒与CD2v缺失株感染。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 原核表达 CD2v 间接ELISA
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影响非洲猪瘟病毒对培养细胞感染性的因素分析
7
作者 冯永智 龚婷 +4 位作者 吴东东 高琦 郑晓宇 张桂红 孙彦阔 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3406-3414,共9页
猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)是非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要靶细胞,除宿主单核/巨噬细胞外,ASFV难以在其他体外细胞系中持续生长繁殖。本研究旨在研究影响ASFV在体外感染能力的因素。通过比较ASFV接种易感细胞PAMs和非易感细胞系3D4/21、PK1... 猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)是非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要靶细胞,除宿主单核/巨噬细胞外,ASFV难以在其他体外细胞系中持续生长繁殖。本研究旨在研究影响ASFV在体外感染能力的因素。通过比较ASFV接种易感细胞PAMs和非易感细胞系3D4/21、PK15细胞的全基因组转录谱差异;使用小分子药物改变细胞代谢或周期、物理方法改变细胞黏附;通过荧光定量PCR、Western blot、红细胞吸附检测病毒在3D4/21和PK15细胞系中的增殖情况。结果表明:ASFV接种3D4/21和PK15两种细胞与PAMs细胞的共同差异基因显著富集在细胞黏附、细胞周期和细胞代谢等方面;使用多种调控细胞周期、细胞代谢的小分子药物处理细胞后对ASFV感染PK15和3D4/21细胞的能力无显著影响;通过悬浮培养来调节细胞的黏附后,显著提高ASFV感染PK15和3D4/21细胞的能力,但随着传代次数的增加,病毒的复制能力逐渐下降。综上所述,细胞黏附可能是影响ASFV体外感染能力的重要因素之一,但是改变细胞黏附后并不能维持ASFV的复制能力。本研究为ASFV体外细胞系的建立提供了初步参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 全基因组转录谱 悬浮培养 体外感染细胞系
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屠宰过程黄羽肉鸡弯曲菌的定量风险评估 被引量：2
8
作者 何海珊 白洁 +9 位作者 李嘉怡 林琦杰 陈凯风 陈泽銮 瞿孝云 刘海霞 梁玉岑 彭钧豪 廖明 张建民 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2022年第18期6017-6025,共9页
目的检测屠宰过程黄羽肉鸡弯曲菌阳性率和污染水平,建立屠宰过程黄羽肉鸡弯曲菌的定量风险评估模型,探明其污染的关键风险点。方法用传统分离鉴定方法和最近似数法(most probable numbers,MPN)对屠宰不同环节弯曲菌阳性率和污染水平进... 目的检测屠宰过程黄羽肉鸡弯曲菌阳性率和污染水平,建立屠宰过程黄羽肉鸡弯曲菌的定量风险评估模型,探明其污染的关键风险点。方法用传统分离鉴定方法和最近似数法(most probable numbers,MPN)对屠宰不同环节弯曲菌阳性率和污染水平进行检测,然后运用描述函数对数据进行拟合,并采用@Risk软件进行重复性检验和敏感性分析。结果弯曲菌阳性率和污染水平以活鸡肛拭环节最高(53.600%,1.8300 logMPN/m2),其次为打毛和开膛环节(27.500%,0.5000 logMPN/m2和18.100%,0.0270 logMPN/m2)。根据函数拟合结果建立弯曲菌污染定量风险评估模型,蒙特卡洛(Monte Carlo)模拟分析显示肛拭环节弯曲菌阳性率和污染水平最高(52.920%,1.8896 logMPN),其次是打毛和开膛环节(27.460%,0.4680 logMPN和14.740%,0.4910 logMPN),各个模拟环节数值与分离鉴定结果误差较小(P<0.05),表明模型具有良好的准确性;敏感性分析获得黄羽肉鸡屠宰过程弯曲菌污染的关键风险点为打毛和开膛环节,相关系数分别为0.77和-0.39,高于其他环节。结论本研究以屠宰过程黄羽肉鸡弯曲菌为研究对象进行风险评估,成功建立弯曲菌暴露评估模型,且模型具有较好的准确性,同时揭示了屠宰过程弯曲菌防控的关键风险点,为黄羽肉鸡弯曲菌的防控和风险评估奠定基础。 展开更多
关键词 黄羽肉鸡 屠宰过程 弯曲菌 风险评估
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