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5种人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的初步建立 被引量：9
1
作者 孙庆歌 杨银辉 +8 位作者 张维军 王群 康晓平 李永强 白宇 童铁钢 杨涛 步志高 吴东来 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期785-789,共5页
为建立可同时检测裂谷热病毒(RVFV)、戊型肝炎病毒(HEV)、狂犬病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)及口蹄疫病毒(FMDV)5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR快速检测方法,本研究根据GenBank登录的上述5种病毒的全基因组序列,设计了5对多重PCR引物,... 为建立可同时检测裂谷热病毒(RVFV)、戊型肝炎病毒(HEV)、狂犬病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)及口蹄疫病毒(FMDV)5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR快速检测方法,本研究根据GenBank登录的上述5种病毒的全基因组序列,设计了5对多重PCR引物,通过优化反应条件,建立检测以上5种病毒的多重RT-PCR方法。通过对同一种属的其他病毒及相关病毒的检测,确定方法的特异性;通过对体外转录合成的RNA进行定量检测的方法,确定方法的敏感度。实验结果表明:在同一RT-PCR反应体系中可同时检测以上5种病毒,扩增片段长度分别为499bp、137bp、274bp、224bp、389bp;而对新城疫病毒(NDV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛流行热病毒(BEFV)和乙型脑炎病毒(JBEV)的检测均为阴性;5种病毒RNA的最低检测拷贝数分别为2.91×104、3.14×103、1.25×103、6.65×103和2.38×104。利用该方法对11份RV已知阳性样本和7份HEV已知阳性样本检测结果均呈阳性。本研究建立了一种快速、可同时检测5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR检测方法,该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。 展开更多
关键词 裂谷热病毒 戊型肝炎病毒 狂犬病毒 水泡性口炎病毒 口蹄疫病毒 多重RT-PCR
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5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立 被引量：9
2
作者 蔡绪禹 康晓平 +9 位作者 刘洪 李裕昌 孙恩成 王凌凤 杨涛 刘霓红 步志高 李文京 杨银辉 吴东来 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期118-121,共4页
为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过... 为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段。 展开更多
关键词 流行性乙型脑炎病毒 森林脑炎病毒 东方马脑炎病毒 西方马脑炎病毒 基孔肯雅病毒 多重RT-PCR
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抗东方马脑炎病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定 被引量：2
3
作者 赵晶 孙恩成 +7 位作者 刘霓红 杨涛 杨银辉 耿宏伟 秦永丽 王凌凤 徐青元 吴东来 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期893-897,共5页
为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以原核表达载体pET-30a... 为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11。Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应。利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33(321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位。本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础。 展开更多
关键词 东方马脑炎病毒 E2蛋白 原核表达 真核表达 单克隆抗体 抗原表位
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