牛乳中致病性金黄色葡萄球菌快速检测胶体金免疫层析方法研究 被引量：8

1

作者 布日额 任晓峰 +5 位作者 吴金花 锡林高娃 王学理 刘燕 孙立杰 刘洋 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期907-911,共5页

为建立快速检测牛乳中致病性金黄色葡萄球菌(S.aureus)的胶体金免疫层析方法,本研究将鼠抗S.aureus IgG进行胶体金标记,并喷涂于玻璃纤维上制备金标垫,分别以兔抗S.aureus nEBPS重组蛋白IgG和羊抗鼠IgG作为检测线和质控线,组装制备快速... 为建立快速检测牛乳中致病性金黄色葡萄球菌(S.aureus)的胶体金免疫层析方法,本研究将鼠抗S.aureus IgG进行胶体金标记,并喷涂于玻璃纤维上制备金标垫,分别以兔抗S.aureus nEBPS重组蛋白IgG和羊抗鼠IgG作为检测线和质控线,组装制备快速检测牛乳中致病性S.aureus胶体金免疫层析试纸条。结果表明:试纸条对致病性S.aureus具有高度特异性,与沙门氏菌、大肠杆菌、布氏杆菌无交叉反应;试纸条最低检出1.0×105cfu/mL的S.aureus。试纸条批内及批间检测试验均具有良好的重复性。试纸条与S.aureus分离鉴定法符合率为90.0%、与PCR试剂盒符合率为83.3%。表明本研究建立的牛乳中致病性S.aureus免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单、快捷等特点,适合于牛乳中致病性S.aureus的现场快速检测。 展开更多

关键词 牛乳 致病性金黄色葡萄球菌 弹性纤维结合蛋白 胶体金免疫层析试纸条

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内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌的分离与鉴定 被引量：5

2

作者 代牡兰 锡林高娃 +4 位作者 吴金花 布日额 邢家辉 王赞嘉 石竞楠 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2023年第5期31-35,共5页

对内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌进行分离并鉴定。以蒙古族传统发酵乳为材料,采用传统的细菌纯培养分离方法分离乳酸菌株,通过形态学特征及生理生化试验初步确定乳酸菌的基础上,进一步利用细菌16S r DNA基因序列分析和系统发育进化树构... 对内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌进行分离并鉴定。以蒙古族传统发酵乳为材料,采用传统的细菌纯培养分离方法分离乳酸菌株,通过形态学特征及生理生化试验初步确定乳酸菌的基础上,进一步利用细菌16S r DNA基因序列分析和系统发育进化树构建,对其种属进行分析鉴定。分析鉴定结果显示,分离得到的29株乳酸菌共鉴定为2个属,6个种。2个属分别为乳酸杆菌属(Lactobacillus)和肠球菌属(Entercoccus),6个种分别为短乳杆菌(Levilaccillus brevis,4株)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum,8株)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis,9株)、鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum,3株)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii,1株)、耐久肠球菌(Enterococcus durans,4株)。该研究采集的发酵乳样品中乳酸菌资源丰富,代表着内蒙古蒙古族传统发酵乳制品中优势性乳酸菌菌种,为优良发酵剂的研发奠定了微生物资源基础。 展开更多

关键词 传统发酵乳 乳酸菌 分离鉴定 16S r DNA基因序列分析

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牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、BP、AP2三基因的串联表达及其免疫原性研究 被引量：4

3

作者 布日额 王金良 +5 位作者 吴金花 锡林高娃 陈金龙 孙立杰 王华 朝洛蒙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期138-141,共4页

为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重叠延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞... 为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重叠延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,表达蛋白经亲和层析纯化后进行western blot鉴定和小鼠免疫实验。结果表明,AP1-AP2-BP融合抗原具有良好的反应原性和免疫原性。本研究为进一步研究无乳链球菌基于AP1-BP-AP2融合蛋白的致病机制、检测制剂及亚单位疫苗研制提供了实验依据。 展开更多

关键词 无乳链球菌 菌毛岛屿 AP1 BP AP2 串联表达

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科尔沁奶牛防御素基因BNBD5原核表达产物的生物活性研究

4

作者 锡林高娃 韩甫鑫 任洪宝 《当代畜禽养殖业》 2020年第3期5-7,共3页

目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结... 目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,并通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌验证抑菌生物活性。结果:成功构建了pET-30a-BNBD5重组载体,经IPTG诱导,pET-30aBNBD5融合表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的多肽分子质量大小相符,证实已得到重组表达产物,通过抑菌试验可知其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌性。结论:获得科尔沁牛防御素BNBD5基因体外表达产物,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。 展开更多

关键词 科尔沁牛β-防御素 BNBD5基因 克隆 原核表达

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以乙型肝炎核心病毒蛋白为载体融合金黄色葡萄球菌IsdA表位多肽的免疫原性 被引量：2

5

作者 白靓 成岩 +2 位作者 刘燕 张树军 曹瑞珍 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期92-95,共4页

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S aureus）,是一种最常见的条件致病菌。可以引起人和动物的多种类疾病,感染牛导致的牛乳房炎给奶牛产业造成巨大损失;感染人可引起皮肤和软组织感染,严重者可出现肺炎、菌血症、脓毒血症、心内... 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S aureus）,是一种最常见的条件致病菌。可以引起人和动物的多种类疾病,感染牛导致的牛乳房炎给奶牛产业造成巨大损失;感染人可引起皮肤和软组织感染,严重者可出现肺炎、菌血症、脓毒血症、心内膜炎及骨髓炎。S aureus中存在大量的耐药株,尤其是耐甲氧西林S aureus,降低了抗生素疗法的可靠性。疫苗可以通过主动免疫或被动免疫途径切断感染辅助抗生素疗法,但至今还没有商品化的S aureus疫苗上市，研发竞赛已在全世界范围展开。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 IsdA 免疫原性 牛乳房炎 抗生素疗法 奶牛产业 主动免疫 脓毒血症 乙型肝炎 病毒蛋白

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禽流感病毒A/duck/Fujian/31/2007(H5N1)株M1基质蛋白的原核表达与免疫原性鉴定 被引量：1

6

作者 布日额 吴金花 +3 位作者 孙立杰 李明刚 刘洋 薛晓阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第6期46-49,共4页

经生物学软件DNAStar分析,参照已发表的禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)(H5N1)基因组序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约750bp的M1基因片段,将目的片段定向克隆至pET30a表达载体,经酶切及测序鉴定正确后转化BL21表达菌... 经生物学软件DNAStar分析,参照已发表的禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)(H5N1)基因组序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约750bp的M1基因片段,将目的片段定向克隆至pET30a表达载体,经酶切及测序鉴定正确后转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,BCA法测定纯化蛋白的浓度为0.656mg/mL,免疫印迹检测结果表明,纯化的重组蛋白具有良好的反应活性。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测结果表明,重组蛋白可产生抗M1蛋白特异性抗体,具有良好的免疫原性。本研究成功表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,且重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研制H5N1亚型流感病毒诊断试剂及基因工程疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 H5N1亚型流感病毒 M1蛋白 原核表达 免疫原性

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蒙古绵羊输卵管组织中β-防御素表达的原位杂交技术检测

7

作者 锡林高娃 任洪宝 曹贵方 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第6期1377-1379,共3页

β-防御素(β-defensin)是一类大量存在于哺乳动物上皮组织内的内源性抗微生物肽,它们在非特异性免疫反应中占重要地位。为阐明蒙古绵羊β-防御素(Sheep beta-defensin,sBD-1)在输卵管组织内的表达定位,以扩增的sBD-1 cDNA作为探针,并... β-防御素(β-defensin)是一类大量存在于哺乳动物上皮组织内的内源性抗微生物肽,它们在非特异性免疫反应中占重要地位。为阐明蒙古绵羊β-防御素(Sheep beta-defensin,sBD-1)在输卵管组织内的表达定位,以扩增的sBD-1 cDNA作为探针,并采用核酸原位杂交技术进行检测。结果表明:sBD-1 mRNA在蒙古绵羊输卵管黏膜层上皮细胞游离面的胞质内表达,固有层、肌层、结缔组织中无表达,符合β-防御素主要表达于黏膜表面细胞的一般规律。 展开更多

关键词 Β-防御素 组织表达 原位杂交

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一株裂解多重耐药性无乳链球菌噬菌体的分离及生物特性分析 被引量：1

8

作者 锡林高娃 梅振宇 +1 位作者 任洪宝 菅瑞珍 《当代畜禽养殖业》 2022年第3期3-6,共4页

噬菌体是一类能够感染细菌的病毒。利用噬菌体控制细菌感染的噬菌体疗法,具有特异性强、自我增殖快、抗菌能力强和研发时间短等优点,特别是对多重耐药菌感染的治疗具有广阔的发展前景。本试验利用乳腺炎临床分离的多重耐药无乳链球菌作... 噬菌体是一类能够感染细菌的病毒。利用噬菌体控制细菌感染的噬菌体疗法,具有特异性强、自我增殖快、抗菌能力强和研发时间短等优点,特别是对多重耐药菌感染的治疗具有广阔的发展前景。本试验利用乳腺炎临床分离的多重耐药无乳链球菌作为宿主,从牛生存环境中的污水样、粪水样中分离特异性裂解噬菌体,并对其生长特性进行分析研究。结果表明,该试验已成功分离出1株多重耐药性粪肠球菌裂解性噬菌体,噬菌斑清晰,潜伏期短,增长速度快。临床分离到的多重耐药性无乳链球菌有着较好的抑菌效果,对自然环境下温度、酸碱度的耐受性较强,为多重耐药菌的治疗提供了理论依据和技术支撑。 展开更多

关键词 粪肠球菌 裂解性噬菌体 耐药性

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牛结核分枝杆菌早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83基因的串联表达及其抗原性鉴定 被引量：2

9

作者 布日额 陈金龙 +3 位作者 叶俊 吴金花 锡林高娃 王金良 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期622-626,共5页

为获得一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌(MB)感染早期标识物MPB70、MPB83分泌性蛋白的串联抗原蛋白,本研究利用DNAStar生物信息软件对MB感染早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83抗原结构区域进行预测后设计合成相应引物,并在两个片段之间引... 为获得一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌(MB)感染早期标识物MPB70、MPB83分泌性蛋白的串联抗原蛋白,本研究利用DNAStar生物信息软件对MB感染早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83抗原结构区域进行预测后设计合成相应引物,并在两个片段之间引入16位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术获得MBP70与MBP83基因的抗原优势区核苷酸串联片段,将其连接至原核表达载体pGEX-6p-1中经诱导、表达,结果显示构建的重组表达载体获得高效表达,目的抗原蛋白的分子质量约58ku,纯化后重组蛋白的纯度>90%,经免疫BALB/c小鼠4次后,抗体效价达到1∶51200。本实验获得了具有明显抗原活性的MB感染早期分泌性蛋白串联抗原MPB70+MPB83,为后续进一步研发MB早期感染标识物快速检测试剂盒奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 MPB70 MPB83 串联表达

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牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿亚基不同组合融合抗原对BALB/c小鼠免疫保护性实验

10

作者 布日额 王金良 +4 位作者 吴金花 锡林高娃 陈金龙 孙立杰 王华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1152-1156,共5页

为评价牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿亚基不同组合融合蛋白AP1-AP2、 AP1-BP、 BP-AP2、AP1-BP-AP2对BALB/c小鼠的免疫保护性,本研究取各融合蛋白与同体积的弗氏佐剂进行乳化,分别制备融合抗原免疫制剂,4种免疫制剂均以50μg/只对小鼠进行... 为评价牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿亚基不同组合融合蛋白AP1-AP2、 AP1-BP、 BP-AP2、AP1-BP-AP2对BALB/c小鼠的免疫保护性,本研究取各融合蛋白与同体积的弗氏佐剂进行乳化,分别制备融合抗原免疫制剂,4种免疫制剂均以50μg/只对小鼠进行4次免疫后均产生了较高滴度的抗体,其中AP1-BP-AP2融合抗原产生的抗体滴度水平最高,可达1∶25 600。在免疫后第50 d时利用104 cfu/mL乳腺炎无乳链球菌攻毒,每天观察记录小鼠的精神状态、食量变化等生理状态。攻毒试验结果显示,4种不同融合抗原均显示不同程度的免疫保护性,其中AP1-BP-AP2融合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护性为最佳,其免疫保护指数PI达到80%。本研究首次创新性地开展牛乳腺炎无乳链球菌Ia亚型PI-2a菌毛岛屿AP1、AP2、BP亚单位不同组合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护试验,获得了AP1-BP-AP2融合抗原的免疫保护效果为最佳的结论,为进一步开发无乳链球菌性乳腺炎防控的亚单位疫苗及其流行病学检测试剂盒提供了实验依据。 展开更多

关键词 菌毛岛屿 融合抗原 免疫保护

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牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白pgk抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立 被引量：13

11

作者 布日额 任晓峰 +5 位作者 吴金花 王学理 刘燕 锡林高娃 孙立杰 刘洋 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期312-316,共5页

为评价牛乳腺炎无乳链球菌重组表面蛋白(pgk)免疫原性,并通过建立检测抗体的间接ELISA方法对免疫抗体效价进行评价,本研究根据GenBank登录的无乳链球菌pgk基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板PCR扩增出pgk蛋白抗原优... 为评价牛乳腺炎无乳链球菌重组表面蛋白(pgk)免疫原性,并通过建立检测抗体的间接ELISA方法对免疫抗体效价进行评价,本研究根据GenBank登录的无乳链球菌pgk基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板PCR扩增出pgk蛋白抗原优势区的编码基因序列。将其插入pET-30a(+)中,并在大肠杆菌中表达。Western blot鉴定表明,表达的重组蛋白与阳性血清具有良好的反应原性。采用纯化的表达产物作为包被抗原建立了检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.115μg/mL,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶4 000。初步应用于检测无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌小鼠阳性血清的检测。结果表明牛乳腺炎无乳链球菌pgk亚单位抗原具有良好的抗原性,抗体检测灵敏度达到1∶4 000,同时表现良好的特异性。 展开更多

关键词 无乳链球菌 pgk亚单位 免疫效果

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基于奶牛乳腺炎无乳链球菌rSip-PGK-FbsA融合蛋白的间接ELISA检测方法的建立 被引量：2

12

作者 吴金花 布日额 +10 位作者 王金良 陈金龙 锡林高娃 孙立杰 王华 王学理 刘燕 杜长智 朝洛蒙 于辰龙 白文丽 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期230-234,共5页

为建立一种快速而准确的奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的无乳链球菌的膜表面相关蛋白SIP、磷酸甘油激酶PGK及纤连蛋白FbsA 3种串联表达的融合蛋白rSip-PGK-FbsA为包被抗原,建立了检测奶牛无乳链球菌抗体的间... 为建立一种快速而准确的奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的无乳链球菌的膜表面相关蛋白SIP、磷酸甘油激酶PGK及纤连蛋白FbsA 3种串联表达的融合蛋白rSip-PGK-FbsA为包被抗原,建立了检测奶牛无乳链球菌抗体的间接ELISA方法。该方法与化脓性链球菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、金黄色葡萄球菌阳性血清、表皮葡萄球菌阳性血清均无交叉反应,特异性良好;阳性血清稀释至1颐12 800仍检测为阳性,具有较高的敏感性;批内和批间试验变异系数均小于10%,重复性好。利用该方法与以SIP、PGK单一蛋白建立的ELISA方法对160份已知样品进行检测,结果显示,该方法的阳性符合率达到98.6%,高于SIP、PGK单一蛋白建立的ELISA方法的阳性符合率。对389份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,其阳性检出率为46.53%。本研究建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种更加准确、可靠的血清学方法。 展开更多

关键词 无乳链球菌 多表位融合抗原rSip-PGK-FbsA 纯化 ELISA检测

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金黄色葡萄球菌表面蛋白nEBPS抗体的制备和纯化 被引量：2

13

作者 锡林高娃 薛晓阳 +1 位作者 吴金花 布日额 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第6期1430-1434,共5页

为了在原核细胞中表达金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白(EBPS),制备多克隆抗体,将构建的p ET30a-n EBPS重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,亲和层析法纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗... 为了在原核细胞中表达金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白(EBPS),制备多克隆抗体,将构建的p ET30a-n EBPS重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,亲和层析法纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,ELISA方法检侧抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗n EBPS多克隆抗体。结果显示,利用p ET30a-n EBPS重组质粒,经原核表达和亲和层析获得了n EBPS蛋白;利用n EBPS蛋白质制备多克隆抗体,间接ELISA检测的纯化抗体效价可达0.686(OD450值),P/N值达6.7。 展开更多

关键词 nEBPS抗体 多克隆抗体 制备 纯化

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禽流感病毒株A/duck/Fujian/31/2007(H5N1)株M1基因的克隆及序列分析 被引量：1

14

作者 布日额 任晓峰 +2 位作者 李明刚 吴金花 孙立杰 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第5期27-30,共4页

参照GenBank公布的禽流感病毒基质蛋白M1基因序列,设计合成了1对特异性引物,采用RT-PCR法成功扩增并克隆了禽流感病毒M1基因。序列测定结果为M1基因cDNA全长759bp,编码252个氨基酸。将其序列与数株甲型流感病毒M1基因序列进行比较,M1基... 参照GenBank公布的禽流感病毒基质蛋白M1基因序列,设计合成了1对特异性引物,采用RT-PCR法成功扩增并克隆了禽流感病毒M1基因。序列测定结果为M1基因cDNA全长759bp,编码252个氨基酸。将其序列与数株甲型流感病毒M1基因序列进行比较,M1基因核苷酸同源性为99.1%～99.6%,推导氨基酸同源性为98.8%～99.6%,生物信息学分析表明,M1基因编码的蛋白质具有亲水性,有很强的抗原性,M1蛋白共有6个潜在的N-糖基化位点,可能存在3个蛋白激酶C磷酸化位点,存在2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。 展开更多

关键词 禽流感病毒 M1基因 克隆 序列分析

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牛结核分枝杆菌MPB70+83MAb的制备及胶体金免疫层析试纸条的初步研制 被引量：5

15

作者 叶俊 布日额 +6 位作者 吴金花 锡林高娃 陈金龙 王金良 刘思国 崔子寅 王思珍 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1131-1136,共6页

为制备牛结核分枝杆菌(MB)感染早期分泌性蛋白MPB70+83的胶体金标记免疫层析试剂条,本研究将构建的重组大肠杆菌p ET30a(+)-MPB70+83/BL21诱导表达,经纯化后免疫小鼠,制备MPB70+83融合蛋白的单克隆抗体(MAb),对MAb标记胶体金后制备检测... 为制备牛结核分枝杆菌(MB)感染早期分泌性蛋白MPB70+83的胶体金标记免疫层析试剂条,本研究将构建的重组大肠杆菌p ET30a(+)-MPB70+83/BL21诱导表达,经纯化后免疫小鼠,制备MPB70+83融合蛋白的单克隆抗体(MAb),对MAb标记胶体金后制备检测试纸,并确定其特异性、灵敏度等技术指标。结果显示,获得分子量为39 ku的MPB70+83融合蛋白,经纯化后重组蛋白的纯度>95%,经4次免疫BALB/c小鼠后,最终获得3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4H6、5A2、4D11,小鼠腹水MAb效价分别达到1∶12800,1∶12800,1∶25600。制备的腹水MAb均经纯化后浓度分别为2.1 mg/m L、1.8 mg/mL、2.5 mg/mL。对杂交瘤细胞经15代培养,MAb均具有良好的稳定性。利用4D11 MAb标记金颗粒,4H6 MAb包被检测线,并对不同培养物人工污染健康牛血清样品进行检测,结果显示,胶体金试纸对人工污染MB培养物的健康牛血清出现阳性反应,对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌培养物人工污染的健康牛血清的检测均为阴性,最低可以检测到1∶2500倍稀释的MB培养上清。本研究为牛结核分枝杆菌感染的快速检测提供可行技术手段。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 MPB70 mpb83 单克隆抗体

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基于奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿rAP1-BP-AP2重组蛋白的间接ELISA方法的建立 被引量：4

16

作者 朝洛蒙 王金良 +4 位作者 布日额 吴金花 孙立杰 锡林高娃 陈金龙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期611-615,共5页

为建立一种快速准确高效的检测奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿抗原相应抗体的检测方法,本研究以牛乳腺炎无乳链球菌Ia型PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、AP2及骨架蛋白BP 3基因串联表达的重组蛋白为ELISA包被抗原,通过方阵滴定法优化反... 为建立一种快速准确高效的检测奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿抗原相应抗体的检测方法,本研究以牛乳腺炎无乳链球菌Ia型PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、AP2及骨架蛋白BP 3基因串联表达的重组蛋白为ELISA包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立了奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体的间接ELISA检测方法。优化后抗原的最佳包被量为5.0μg/孔,血清样品最佳稀释倍数为1∶40,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶5 000。对S.agalactiae、S.pyogens、E.coli、S.aureus、S.epidermidis阳性血清进行检测结果显示,后4种阳性对照血清未出现阳性反应,表明该方法具有良好的特异性;对已知牛无乳链球菌阳性血清倍比稀释后进行检测时,当稀释倍数达到1:12 800时仍出现阳性结果,表明该方法具有较高的敏感度;重复性试验显示批内变异系数为2.41%~8.89%,批间试验变异系数为7.53%~10.46%;用该方法对426份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,结果显示,其样品阳性检出率为45.07%。本研究首次基于乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿三联重组蛋白建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种准确、可靠的检测方法。 展开更多

关键词 牛乳腺炎 无乳链球菌 菌毛岛屿PI-2a 重组蛋白AP1-BP-AP2 ELISA

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牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP基因亚单位抗体的制备 被引量：4

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作者 王雪吟 布日额 +3 位作者 陈金龙 王金良 吴金花 锡林高娃 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期206-211,共6页

目的构建牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a亚单位重组抗原AP_1-AP_2-BP,并制备其多亚单位抗体,为后期研制新型免疫疫苗和检测试剂提供实验基础。方法利用延伸PCR技术构建了AP_1-AP_2-BP三联基因,并将该串联基因进行转化,诱导,表达,纯化... 目的构建牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a亚单位重组抗原AP_1-AP_2-BP,并制备其多亚单位抗体,为后期研制新型免疫疫苗和检测试剂提供实验基础。方法利用延伸PCR技术构建了AP_1-AP_2-BP三联基因,并将该串联基因进行转化,诱导,表达,纯化,并将纯化蛋白制作为抗原,对家兔免疫,制备多亚单位抗体,并通过亲和层析的方式从免疫后的血清中获得纯化的IgG,完成多亚单位抗体的制备。结果 AP_1-AP_2-BP三基因串联重组工程菌株通过诱导、表达,对产物亲和层析等方法获得的纯化蛋白,其相对分子质量为65 kDa,其含量达到3.3 mg/mL,并具有较好的免疫原性。经间接ELISA可知,经过4周的免疫抗体的滴度已达到1∶5 600的水平。通过Protein A280测量数据表明,纯化后的IgG的含量高达9.1 mg/mL。结论牛乳腺炎无乳链球菌的菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP三基因串联重组工程菌经诱导、表达后获得的纯化蛋白AP_1-AP_2-BP多亚单位抗原有较好的免疫原性,为制备相应多亚单位抗体的制备提供了良好的多价抗原,同时为将研制新型工程疫苗及检测试剂提供了科学研究基础。 展开更多

关键词 无乳链球菌 AP1-AP2-BP 蛋白纯化 亚单位抗体

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牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚基单克隆抗体胶体金标记试纸条制备 被引量：3

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作者 布日额 吴金花 +2 位作者 锡林高娃 陈金龙 王金良 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期45-49,共5页

目的本研究通过优化牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚单位单克隆抗体的性能,制备胶体金标记检测牛乳腺炎无乳链球菌的试纸条。方法利用pET30a(+)-BP重组质粒表达蛋白纯化物免疫小鼠,无菌取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选杂交瘤细... 目的本研究通过优化牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚单位单克隆抗体的性能,制备胶体金标记检测牛乳腺炎无乳链球菌的试纸条。方法利用pET30a(+)-BP重组质粒表达蛋白纯化物免疫小鼠,无菌取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选杂交瘤细胞,制备单克隆抗体,对单克隆抗体进行胶体金标记后制备检测试剂盒,并确定其灵敏度、特异性等技术指标。结果经数轮筛选,获得1株阳性杂交瘤细胞株,抗体效价达到1∶25600。胶体金标记试纸条灵敏度量达到10~6 CFU/mL。特异性测试结果表明,胶体金标记试纸条与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌、化脓性链球菌培养物人工污染的牛乳样均无阳性反应,只与无乳链球菌乳样出现阳性结果。结论该胶体金标记免疫层析试纸条,具有实际应用价值,将为牛乳腺炎的筛查检测提供新型、便捷的技术产品。 展开更多

关键词 无乳链球菌 BP基因 单克隆抗体 胶体金

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牛乳腺炎粪肠球菌cylA基因对牛外周血单核巨噬细胞完全吞噬功能的影响 被引量：3

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作者 王赞嘉 锡林高娃 +3 位作者 吴金花 布日额 邢家辉 代牡兰 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期178-183,共6页

探索奶牛乳腺炎粪肠球菌cylA基因对体外培养的单核巨噬细胞完全吞噬功能的影响。通过体外培养牛外周血单核巨噬细胞(BMC-7),利用牛乳腺炎粪肠球菌野生型菌株(BME1708)和cylA基因敲除突变株(BME1708ΔcylA)按照不同时间梯度侵染BMC-7,利... 探索奶牛乳腺炎粪肠球菌cylA基因对体外培养的单核巨噬细胞完全吞噬功能的影响。通过体外培养牛外周血单核巨噬细胞(BMC-7),利用牛乳腺炎粪肠球菌野生型菌株(BME1708)和cylA基因敲除突变株(BME1708ΔcylA)按照不同时间梯度侵染BMC-7,利用台酚蓝染色显微镜观察法,统计不同时间BMC-7对BME1708和BME1708ΔcylA的吞噬率和吞噬指数的差异。结果表明随着时间的延续,吞噬率和吞噬指数存在动态变化,至48 h时BMC-7对BME1708的吞噬率和吞噬指数分别为25%和2.3,而对BME1708ΔcylA的吞噬率和吞噬指数分别为50%和5.5。随着时间的进一步延续,巨噬细胞开始死亡。说明溶血素cylA基因阳性的粪肠球菌菌株对巨噬细胞的吞噬作用具有一定的负调控作用,并且在巨噬细胞内的存活率相对高,在单核巨噬细胞内存在一定的“内生”现象,这一现象可能是由该致病菌引起的牛乳腺炎常反复、难治愈的分子机制之一。 展开更多

关键词 牛单核巨噬细胞 粪肠球菌 侵染实验

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