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Agtpbp1基因敲除小鼠模型的构建及初步表型分析
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作者 常越 宋婧源 +5 位作者 杨晨曦 宋呼德尔 鲁厚可 张传领 任建军 肖瑞 《中国病理生理杂志》 北大核心 2025年第7期1449-1456,共8页
目的:采用CRISPR/Cas9技术构建并繁育出携带ATP/GTP结合羧肽酶1(Agtpbp1)基因敲除纯合子(Agtpbp1-/-)不育模型小鼠,为后续探究Agtpbp1基因在雄性不育中的发病机制提供动物模型。方法:采用CRISPR/Cas9技术,根据Agtpbp1基因的主要蛋白功... 目的:采用CRISPR/Cas9技术构建并繁育出携带ATP/GTP结合羧肽酶1(Agtpbp1)基因敲除纯合子(Agtpbp1-/-)不育模型小鼠,为后续探究Agtpbp1基因在雄性不育中的发病机制提供动物模型。方法:采用CRISPR/Cas9技术,根据Agtpbp1基因的主要蛋白功能区域的数据结果并结合Cas9核酸酶以此获取Agtpbp1基因敲除杂合子(Agtpbp1^(+/-))小鼠。将所获得杂合子小鼠雌雄交配,对其后代使用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因型结果判定。利用RT-PCR、Western blot和免疫组化染色检测Agtpbp1在不同水平上的表达情况,佐证鉴定结果。HE染色观察小鼠小脑及眼球结构以此来分析Agtpbp1基因敲除对浦肯野细胞和光感受器细胞的影响。结合行为学测试观察小鼠的共济失调症状。观察小鼠生长情况,分析雄性小鼠睾丸组织体积及重量变化,HE染色观察睾丸结构变化,PAS染色观察睾丸生殖细胞周期变化,最后利用精子分析仪分析小鼠精子活力,以此来分析小鼠的生长发育情况。结果:杂合子雌雄小鼠可继续交配,后代可获得3种基因型:Agtpbp1野生型(Agtpbp1+/+)、Agtpbp1^(+/-)和Agtpbp1-/-,用PCR成功鉴定出子代小鼠的基因型。RT-PCR、Western blot和免疫组化染色分别在不同水平验证Agtpbp1-/-小鼠模型构建成功(P<0.05)。HE染色结果显示,Agtpbp1-/-小鼠小脑中丢失浦肯野细胞且眼球中感光细胞数量减少。行为学测试证实,Agtpbp1-/-小鼠存在运动功能障碍、动作不协调等共济失调症状。与对照组相比,Agtpbp1-/-小鼠睾丸体积和重量均显著降低。HE染色观察到Agtpbp1-/-小鼠睾丸中极少量精子出现,结合精子分析仪观察到该小鼠精子无论是活率、活力还是运动速率,均显著低于对照组。睾丸切片PAS染色结果显示,Agtpbp1-/-小鼠精子发生周期发生阻滞。结论:本研究成功繁育出Agtpbp1全身敲除模型小鼠。Agtpbp1的缺失引起成年雄性小鼠生精细胞分化阻滞,精子活力降低而出现不育。本研究为进一步探究Agtpbp1引起雄性不育的分子机制提供了新的实验工具。 展开更多
关键词 Agtpbp1基因 浦肯野细胞变性 CRISPR/Cas9技术 精子发生 雄性不育
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男性新型冠状病毒肺炎患者生殖系统损伤机制研究进展 被引量:2
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作者 王万伦 肖瑞 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1069-1074,共6页
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在发病率和严重程度上存在显著的性别差异,同年龄段中男性患者多于女性患者。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)利用血管紧张素转换酶(ACE)2受体进入人体细胞。由于ACE2在人类多个器官系统上有不同程度的表达,SARS-Co... 新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在发病率和严重程度上存在显著的性别差异,同年龄段中男性患者多于女性患者。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)利用血管紧张素转换酶(ACE)2受体进入人体细胞。由于ACE2在人类多个器官系统上有不同程度的表达,SARS-CoV-2除感染呼吸系统外,同样可以感染消化系统、神经系统、免疫系统等。睾丸为富含ACE2的器官之一,部分男性COVID-19患者精液中检出SARS-CoV-2,SARS-CoV-2可能损伤生殖系统。但SARS-CoV-2参与男性生殖系统损害的机制尚未完全阐明,目前研究主要集中在SARS-CoV-2对男性生殖的短期影响,并越来越重视其长期影响。本文总结了SARS-CoV-2介导男性COVID-19患者的生殖细胞损伤、性腺功能减退、睾丸炎症的可能机制,并指出目前研究存在的问题,为男性COVID-19患者生殖系统损伤的机制研究扩宽思路。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 血管紧张素转换酶2 男性生殖
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小鼠初级精母细胞GC-2中TUBB4B的表达及其对NF-κB和MAPK信号通路的调控
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作者 刘桐佳 王万伦 +4 位作者 张婷 刘爽 边艳超 张传领 肖瑞 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期1002-1009,共8页
目的探究微管蛋白(TUBB4B)与胞浆羧肽酶(CCP1)在小鼠初级精母细胞(GC-2)中的互相作用关系,以及TUBB4B在调控GC-2发育中的作用。方法使用慢病毒感染GC-2细胞分别构建TUBB4B基因敲减组(TUBB4B-KD组)和阴性对照组(NCKD组);TUBB4B基因过表达... 目的探究微管蛋白(TUBB4B)与胞浆羧肽酶(CCP1)在小鼠初级精母细胞(GC-2)中的互相作用关系,以及TUBB4B在调控GC-2发育中的作用。方法使用慢病毒感染GC-2细胞分别构建TUBB4B基因敲减组(TUBB4B-KD组)和阴性对照组(NCKD组);TUBB4B基因过表达组(TUBB4B-OE组)与阴性对照组(NC-OE组),利用嘌呤霉素筛选稳定细胞株。采用RT-qPCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测细胞模型是否构建成功,并进一步探究在GC-2细胞中TUBB4B与CCP1二者之间相互调控的表达关系。CCK8及流式细胞术检测TUBB4B沉默和过表达后对GC-2细胞增殖及周期的影响;Western blot及细胞免疫荧光实验找出TUBB4B沉默和过表达后发生表达改变的信号通路因子,并在细胞水平上进行标记验证。结果GC-2中与NC-KD(NC-OE)组相比,TUBB4B沉默和过表达后,CCP1在mRNA和蛋白水平上的表达均发生一致的性改变(P<0.05);同样CCP1敲减和恢复表达后与NC组相比,TUBB4B的表达也随之发生一致的性改变(P<0.05)。CCK8和流式细胞术实验发现TUBB4B敲减和过表达对GC-2的增殖速率和细胞的周期无明显改变。Western blot和细胞免疫荧光实验显示TUBB4B敲减和过表达后,细胞中核因子κB(NF-κB)信号通路关键蛋白:p65,p-p65与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路关键蛋白:ErK1/2,p-ErK1/2会发生相应的明显改变(P<0.05);而CCP1敲减后会明显影响PolyE表达(P<0.05)。结论在GC-2细胞中TUBB4B与CCP1表达相互调控为正向作用,且CCP1对TUBB4B具有去谷氨酰化修饰作用,TUBB4B参与初级精母细胞中NF-κB和MAPK信号通路的调控。 展开更多
关键词 雄性不育 胞浆羧肽酶 微管蛋白 初级精母细胞 NF-ΚB通路 MAPK通路
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二甲双胍对小鼠睾丸间质细胞的体外抑制作用及其机制研究
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作者 李蕊秀 赵昍朋 +5 位作者 刘婧 吴家栋 何瑞平 岳鑫 张传领 肖瑞 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2018年第16期2634-2637,2643,共5页
目的探讨二甲双胍在小鼠睾丸发育中的作用及其分子机制。方法不同浓度二甲双胍作用于小鼠睾丸间质细胞(TM3),采用MTT法、Annexin V-FITC/PI法及流式细胞术检测二甲双胍对TM3细胞增殖、凋亡及周期的影响。采用real-time PCR检测细胞周期... 目的探讨二甲双胍在小鼠睾丸发育中的作用及其分子机制。方法不同浓度二甲双胍作用于小鼠睾丸间质细胞(TM3),采用MTT法、Annexin V-FITC/PI法及流式细胞术检测二甲双胍对TM3细胞增殖、凋亡及周期的影响。采用real-time PCR检测细胞周期关键调节蛋白cyclin B1和cyclin D1的变化,Western Blot分析二甲双胍抑制TM3细胞增殖中AMPK蛋白的变化。结果 MTT结果显示二甲双胍可显著抑制TM3细胞的体外增殖能力;Annexin V-FITC/PI染色法显示二甲双胍未诱导该细胞发生凋亡;流式细胞术检测发现二甲双胍可诱导TM3细胞周期阻滞在G2/M期;real-time PCR显示二甲双胍可下调cyclinB1和cyclin D1 m RNA的表达;Western Blot显示二甲双胍显著增加TM3细胞中AMPK在Thr172位点的磷酸化水平。结论二甲双胍显著抑制TM3细胞的体外增殖并通过诱导TM3细胞周期阻滞在G2/M期,激活AMPK信号通路,发挥其对TM3细胞的体外抑制作用。 展开更多
关键词 二甲双胍 小鼠睾丸间质细胞 AMPK CYCLIN B1 CYCLIN D1
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