蒙古马马胃蝇三龄幼虫形态鉴定和种系发育关系分析

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作者 董俊斌 包海泉 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第2期57-61,共5页

为了明确内蒙古自治区呼和浩特市和通辽市蒙古马马胃蝇蛆病病原种类和种系发育关系,本试验于2023年3月在呼和浩特市和通辽市屠宰场采集马胃蝇三龄幼虫120只,利用光学显微镜和扫描电子显微镜对其进行形态学鉴定;通过PCR方法扩增其线粒体... 为了明确内蒙古自治区呼和浩特市和通辽市蒙古马马胃蝇蛆病病原种类和种系发育关系,本试验于2023年3月在呼和浩特市和通辽市屠宰场采集马胃蝇三龄幼虫120只,利用光学显微镜和扫描电子显微镜对其进行形态学鉴定;通过PCR方法扩增其线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)基因,并利用MEGA 6.0和DnaSP 5.0软件将COXⅠ基因序列与GenBank中胃蝇科、皮蝇科和狂蝇科昆虫COXⅠ基因序列进行比对分析,并构建系统发育树;同时对呼和浩特市和通辽市的马胃蝇三龄幼虫进行线粒体COXⅠ基因单倍型和遗传分化分析。结果显示,本试验采集的马胃蝇三龄幼虫体色呈粉红色、口脊末端平滑,形态特征与黑腹胃蝇三龄幼虫一致。系统发育分析结果显示,通辽市黑腹胃蝇TONGLIAO1、TONGLIAO2、TONGLIAO3和TONGLIAO4与呼和浩特市黑腹胃蝇HUHEHAOTE2处于同一分支,呼和浩特市黑腹胃蝇HUHEHAOTE1与GenBank数据库中胃蝇科黑腹胃蝇处于同一分支,2个地区的黑腹胃蝇均与胃蝇科鼻胃蝇、红尾胃蝇和肠胃蝇处于不同分支,与皮蝇科、狂蝇科和外群双翅目麻蝇科距离较远。马胃蝇三龄幼虫COXⅠ基因相似性比对结果与系统发育分析结果一致。呼和浩特市和通辽市黑腹胃蝇线粒体COXⅠ基因序列共含有5个单倍型,二者没有共享单倍型,遗传分化系数(Fst)值大于0.05,基因流(Nm)为4。结果表明,呼和浩特市和通辽市蒙古马马胃蝇蛆病病原为黑腹胃蝇,且亲缘关系较近,未出现遗传分化。 展开更多

关键词 蒙古马 黑腹胃蝇 形态学鉴定 发育树分析

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2018年内蒙古察右后旗绵羊捻转血矛线虫流行病学调查及耐药性检测 被引量：10

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作者 赵学亮 刘晓磊 +3 位作者 苏倩 王姝懿 孙柯 王文龙 《中国动物检疫》 CAS 2019年第5期6-10,共5页

为了解草原放牧绵羊捻转血矛线虫流行情况及目前常用驱虫药物的耐药情况,2018年3—10月,根据不同草场类型、不同养殖模式,在内蒙古乌兰察布市察右后旗贲红、白音察干、大陆号、锡林郭勒、土牧尔台5个地区选择16个牧场,每个牧场随机选择1... 为了解草原放牧绵羊捻转血矛线虫流行情况及目前常用驱虫药物的耐药情况,2018年3—10月,根据不同草场类型、不同养殖模式,在内蒙古乌兰察布市察右后旗贲红、白音察干、大陆号、锡林郭勒、土牧尔台5个地区选择16个牧场,每个牧场随机选择15只绵羊,共240只,进行绵羊捻转血矛线虫检测,发现绵羊捻转血矛线虫平均感染率为75%,平均感染强度为14.8×200个/g;选取6个牧场的感染率和感染强度都较大的绵羊进行驱虫试验,发现有5个牧场的绵羊捻转血矛线虫对阿苯达唑和伊维菌素产生了较强的耐药性。调查结果表明,察右后旗的绵羊捻转血矛线虫流行较为普遍,羊群感染较为严重,且对阿苯达唑、伊维菌素产生了不同程度的耐药性。结果提示,加强捻转血矛线虫的耐药性监测,研发新的驱虫药物,优化驱虫措施,防止盲目用药,同时加强饲养管理,改善圈舍和牧地环境卫生,依然是有效防控绵羊捻转血矛线虫的重要途径。 展开更多

关键词 捻转血矛线虫 耐药性 流行病学调查

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基于DIA技术的多药耐药性捻转血矛线虫蛋白质组学分析

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作者 李炎夫 贾晓晴 +10 位作者 马梅清 杜山 焦万明 马园 郝陆瑶 张艳妮 李倩楠 郭志凯 丁玉林 陆静 王瑞 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第5期65-72,共8页

为探索驱虫药耐药性产生的机制,本试验对捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)的第3期幼虫(L3)以伊维菌素、阿苯达唑和左旋咪唑药物进行处理,采用数据非依赖性采集(DIA)蛋白质组测序技术对捻转血矛线虫L3经药物作用前后的蛋白质进行差异... 为探索驱虫药耐药性产生的机制,本试验对捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)的第3期幼虫(L3)以伊维菌素、阿苯达唑和左旋咪唑药物进行处理,采用数据非依赖性采集(DIA)蛋白质组测序技术对捻转血矛线虫L3经药物作用前后的蛋白质进行差异表达分析,以筛选表达差异的多药耐药性相关蛋白质。结果显示,共鉴定出1 888个差异表达蛋白质,其中63个与多药耐药性相关;进一步的深入分析揭示,有36个蛋白质的表达差异显著(P <0.05),而25个是捻转血矛线虫特有的、与耐药性相关的差异表达蛋白质。基因本体论(GO)分析结果显示,共有60个差异表达耐药性蛋白质被归类于生物学领域的76个分支中;京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析结果显示,有46个表达水平不同的蛋白质富集到脂质代谢和内分泌系统等75条信号通路中。综合分析发现,有5个捻转血矛线虫特有的耐药性蛋白质表达水平差异显著,分别为含有UDP-葡萄糖醛基转移酶结构域的部分蛋白质、抗原H11、免疫球蛋白v组和i组、含有酪氨酸蛋白激酶(PTK)结构域的蛋白质及含有致命巨幼虫同源结构域2的蛋白质,这些蛋白质均参与重要的生物学过程和关键代谢通路。本试验所获结果为揭示差异表达蛋白质与捻转血矛线虫脂类代谢、内分泌系统和多药耐药性的关系提供了基础数据,对探明捻转血矛线虫多药耐药性产生的机制具有重要意义。 展开更多

关键词 多药耐药性 捻转血矛线虫 数据非依赖性采集(DIA) 蛋白质组学 耐药性相关蛋白质

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莫诺拉韦在体外/体内抗H1N1流行性感冒病毒感染特点的研究

4

作者 冯茜莉 王进千 +3 位作者 杨宣叶 胡欣妍 丁玉林 马晓霞 《中国感染控制杂志》 北大核心 2025年第4期478-485,共8页

目的分析莫诺拉韦在体内和体外对流行性感冒(流感)病毒的抗病毒效果。方法检测莫诺拉韦对流感病毒H1N1 PR8毒株在体外和体内的抗病毒能力。以人源非小细胞肺癌细胞系(A549细胞)作为PR8感染的体外模型,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-... 目的分析莫诺拉韦在体内和体外对流行性感冒(流感)病毒的抗病毒效果。方法检测莫诺拉韦对流感病毒H1N1 PR8毒株在体外和体内的抗病毒能力。以人源非小细胞肺癌细胞系(A549细胞)作为PR8感染的体外模型,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、免疫印迹试验(WB)、噬斑的方法,分析莫诺拉韦体外对病毒复制、蛋白合成及病毒颗粒形成方面的抗病毒效果。以PR8滴鼻感染C57BL/6雌性小鼠为体内感染模型,分别从病毒载量、病理变化及免疫组化方面,对对照组、给药组、接毒组和接毒-给药组进行检测,以评估莫诺拉韦的抗病毒能力。结果体外试验结果显示,莫诺拉韦对流感病毒的复制、蛋白合成及病毒颗粒形成没有明显抑制作用(均P>0.05)。小鼠体内试验结果显示,与单纯感染H1N1小鼠相比,接受莫诺拉韦治疗的小鼠肺组织病毒载量明显下降,病理变化程度较轻,免疫组化检测显示核蛋白(NP)抗原信号明显减弱,干扰素(IFN)-α、白细胞介素(IL)-4和IL-6在肺中的表达水平较低(均P<0.01)。结论作为具有抗病毒活性的前体物,莫诺拉韦无法在体外培养的肺源细胞中发挥抗病毒活力,但可以在宿主体内转化为活性形式,显著降低H1N1流感病毒在肺增殖的能力,进而减轻病毒对肺组织的损伤。 展开更多

关键词 莫诺拉韦 流行性感冒 抗病毒 感染模型 病理变化 H1N1

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牛病毒性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

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作者 王亚新 陈萌萌 +4 位作者 王露 李欣 赵洪哲 温永俊 王凤雪 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第4期131-138,共8页

为建立一种针对牛病毒性腹泻病毒的检测方法,本研究针对牛病毒性腹泻病毒的5'UTR设计特异性引物及TaqMan探针,进行扩增,进而构建阳性重组质粒。经过条件优化建立了牛病毒性腹泻病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的实... 为建立一种针对牛病毒性腹泻病毒的检测方法,本研究针对牛病毒性腹泻病毒的5'UTR设计特异性引物及TaqMan探针,进行扩增,进而构建阳性重组质粒。经过条件优化建立了牛病毒性腹泻病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在1×10^(4)~1×10^(8)拷贝/μL时,线性关系良好,线性相关系数R2=0.998;该方法最低检测限为10拷贝/μL;可以特异性检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV),与牛冠状病毒(BCV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3),以及牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应,病毒滴度与拷贝数线性关系良好,线性相关系数R2=0.997;与商品化检测试剂盒的符合率为97.5%。该方法为牛病毒性腹泻病毒的早期快速诊断提供了有力的技术支持。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 TaqMan荧光定量PCR 5'UTR

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乳酸菌CC2株胞外代谢产物的抑菌活性及成分研究

6

作者 谷香 杜山 +5 位作者 马园 魏伟 姚岭柏 王瑞 王伟国 程超 《动物医学进展》 北大核心 2025年第11期1-9,共9页

为探究前期分离纯化出的具有显著抑菌活性的乳酸菌CC2株的抑菌活性及主要抑菌活性成分,首先对该菌株胞外代谢产物的理化性质进行初步研究,筛选其最适的粗提方法并探索其最适抑菌条件,最后利用LC-MS/MS鉴定其主要抑菌活性成分。结果表明... 为探究前期分离纯化出的具有显著抑菌活性的乳酸菌CC2株的抑菌活性及主要抑菌活性成分,首先对该菌株胞外代谢产物的理化性质进行初步研究,筛选其最适的粗提方法并探索其最适抑菌条件,最后利用LC-MS/MS鉴定其主要抑菌活性成分。结果表明,乳酸菌CC2株胞外代谢产物在40℃、pH5时抑菌活性最好,经紫外线和多种消化酶处理后抑菌活性下降;最适提取方法为硫酸铵沉淀法,硫酸铵饱和度为65%时可获得大量抑菌物质,且抑菌活性最强。LC-MS/MS检测显示,该菌株胞外代谢产物中的主要抑菌成分为含LysM结构域的肽聚糖水解酶以及包含多种具有抑菌活性的蛋白质。研究确定了乳酸菌CC2株抑菌活性物质的理化性质和主要成分,且在40℃、pH5时抑菌活性最佳,为解决抗生素滥用和耐药性问题提供了新的思路及重要的基础数据。 展开更多

关键词 乳酸菌 理化性质 抑菌活性成分

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基于CRISPR-Cas12a核酸检测研究进展 被引量：3

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作者 刘晓婷 李鹏 +4 位作者 左柯铭 陈萌萌 王亚新 王凤雪 温永俊 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期94-98,共5页

由病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他病原微生物引起的疾病对人类健康构成极大威胁,如果能在疾病早期检测出来,就能够对传染性疾病起到关键的预防作用。近些年来,CRISPR-Cas系统在检测病原方面已被广泛应用,其中CRISPR-Cas12a弥补了Cas9... 由病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他病原微生物引起的疾病对人类健康构成极大威胁,如果能在疾病早期检测出来,就能够对传染性疾病起到关键的预防作用。近些年来,CRISPR-Cas系统在检测病原方面已被广泛应用,其中CRISPR-Cas12a弥补了Cas9的不能多点编辑的缺陷和Cas12a靶向DNA的特性,成为了热门的核酸检测工具。论文综述了Cas12a与Cas9的不同之处、Cas12a的发现、CRISPR-Cas12a的信号检测平台以及目前使用的检测方法。 展开更多

关键词 CRISPR-Cas12a 核酸检测 病毒

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鸽圆环病毒Cap基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量：1

8

作者 韩晓语 杨俊杰 +4 位作者 赵洪哲 郭昊 王亚新 温永俊 王凤雪 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第3期95-101,共7页

为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Cap保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明:在最佳反应条件... 为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Cap保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明:在最佳反应条件下,所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1×10^(2)~1×10^(7) copies/μL标准品范围内具有良好的线性相关性,线性相关系数为0.9846;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到1×10^(2) copies/μL标准品,是常规PCR检测方法的100倍;特异性试验结果显示,该方法与其他常见的鸽病病原不发生交叉反应;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于2%;所建立PiCV荧光定量PCR方法对临床病死鸽肝脏样品检测结果显示,PiCV阳性率达75.7%,高于常规PCR方法的检测阳性率(54.1%),说明该方法具有良好的适用性。可应用于对PiCV的快速检测,为PiCV的及时防控提供有力技术支持。 展开更多

关键词 Cap基因 鸽圆环病毒 实时定量PCR

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蓝刺头黄酮对小鼠血清免疫指标和抗氧化指标的影响 被引量：5

9

作者 王宇 王涵 +5 位作者 齐雅清 肖乾 张宇超 张馨月 李舒涵 林定邦 《饲料研究》 CAS 北大核心 2023年第20期89-92,共4页

试验旨在研究蓝刺头黄酮对小鼠免疫指标和抗氧化指标的影响。选取80只昆明小鼠,随机分为4组,每组20个重复,每个重复1只鼠。低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠分别灌服100、200、400 mg/kg蓝刺头黄酮溶液,空白对照组灌服等量蒸馏水。试验... 试验旨在研究蓝刺头黄酮对小鼠免疫指标和抗氧化指标的影响。选取80只昆明小鼠,随机分为4组,每组20个重复,每个重复1只鼠。低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠分别灌服100、200、400 mg/kg蓝刺头黄酮溶液,空白对照组灌服等量蒸馏水。试验期30 d。结果显示,与对照组相比,各剂量组小鼠胸腺、脾脏指数均升高(P>0.05),高剂量组小鼠胸腺指数显著高于对照组(P<0.05)。高剂量组小鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白A(IgA)含量显著高于对照组(P<0.05),免疫球蛋白M(IgM)含量略高于对照组(P>0.05);中剂量组小鼠血清中IgA含量显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,高剂量组、中剂量组小鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)含量极显著降低(P<0.01),高剂量组小鼠血清白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量显著降低(P<0.05),中剂量组小鼠血清IL-6含量显著降低(P<0.05)。高、中、低剂量组小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著高于对照组(P<0.05),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著高于对照组(P<0.01);高、低剂量组小鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)极显著高于对照组(P<0.01),高剂量组小鼠血清丙二醛(MDA)含量极显著低于对照组(P<0.01)。研究表明,蓝刺头黄酮能够促进小鼠免疫器官发育,增强小鼠机体抗氧化能力,从而有效改善机体免疫功能,灌服400 mg/kg蓝刺头黄酮溶液效果最佳。 展开更多

关键词 蓝刺头 黄酮 小鼠 脏器指数 抗氧化指标 细胞因子 免疫指标

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荷斯坦育成母牛结核性脑膜脑炎的病理学观察和病原鉴定

10

作者 王金玲 董玉慧 +4 位作者 李彦军 刘永宏 丁玉林 刘淑英 周向梅 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第1期120-124,共5页

为了探究1例荷斯坦育成母牛结核性脑膜脑炎病例的病理变化并鉴定病原,本试验对1头24月龄病死荷斯坦育成母牛进行临床症状观察、尸体剖检和组织病理学观察,随后进行细菌分离培养,并通过抗酸染色和多位点PCR方法进行菌种鉴定。结果显示:... 为了探究1例荷斯坦育成母牛结核性脑膜脑炎病例的病理变化并鉴定病原,本试验对1头24月龄病死荷斯坦育成母牛进行临床症状观察、尸体剖检和组织病理学观察,随后进行细菌分离培养,并通过抗酸染色和多位点PCR方法进行菌种鉴定。结果显示:发病牛临床表现共济失调、转圈、四肢及全身肌肉抽搐、眼球球结膜外突和角弓反张,病程数月;尸检可见脑底部表面、脑室内表面、肺脏、肾脏及后纵膈淋巴结表面和切面散在或密布大小不等的粟粒状黄白色结节;组织病理学观察结果显示,大脑、小脑、脑干、侧脑室和第四脑室的蛛网膜下腔内和局部脑实质内,以及肺脏、肾脏和后纵膈淋巴结内均有大小不等的典型结核性肉芽肿;将分离和纯培养的结核杆菌菌落制备涂片进行抗酸染色,可观察到散在或成簇红染的细长的分枝状小杆菌;分离菌株经结核分枝杆菌复合群(MtbC)的特异性多位点PCR鉴定为牛分枝杆菌。本试验在国内首次描述了由牛分枝杆菌引起荷斯坦育成母牛结核性脑膜脑炎病例的病理变化,为牛结核病的诊断和研究提供参考。 展开更多

关键词 荷斯坦育成母牛 结核性脑膜脑炎 抗酸染色 多位点PCR 牛分枝杆菌

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幼龄长颈鹿坏死杆菌病的诊断和病理学观察

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作者 郭文瑞 郑秉武 +4 位作者 曹霞 丁玉林 黄金田 杨龙峰 王金玲 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第10期72-75,共4页

坏死杆菌病是由厌氧的革兰阴性坏死杆菌引起的一种综合征性疾病,主要感染家养反刍动物 [1] 、野生反刍动物 [2-6] 和袋鼠 [7-10] ,偶尔感染人类。牛和羊是最易感染坏死杆菌的家畜。野生反刍动物的坏死杆菌病已报道于野生叉角羚( Antiloc... 坏死杆菌病是由厌氧的革兰阴性坏死杆菌引起的一种综合征性疾病,主要感染家养反刍动物 [1] 、野生反刍动物 [2-6] 和袋鼠 [7-10] ,偶尔感染人类。牛和羊是最易感染坏死杆菌的家畜。野生反刍动物的坏死杆菌病已报道于野生叉角羚( Antilocapra americana ) [2] 、苔原驯鹿( Rangifer tarandustarandus ) [3] 、黑尾鹿( Odocoileus hemionus columbianus ) [11] 、欧洲野牛(B ison bonasus ) [5] 和羊驼( Vicugna pacos ) [6] 。坏死杆菌病的主要疾病表现包括坏死性口炎、蹄皮炎、阴茎包皮炎、瘤胃炎、肝脓肿、静脉炎、支气管性肺炎,甚至引起脓毒败血症。 展开更多

关键词 坏死杆菌病 脓毒败血症 病理学观察 欧洲野牛 坏死性口炎 羊驼 反刍动物 黑尾鹿

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Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定 被引量：7

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作者 范峻豪 赵洪哲 +3 位作者 王昊 张静 王凤雪 温永俊 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第1期45-49,共5页

为了解内蒙古呼和浩特部分地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况,本研究采用RTPCR技术从采集自内蒙古某屠宰场的32份牛肺脏样品中检测出两株BVDV,命名为BVDV-HT1704、BVDV-HT1723株。通过在MDBK细胞上传... 为了解内蒙古呼和浩特部分地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况,本研究采用RTPCR技术从采集自内蒙古某屠宰场的32份牛肺脏样品中检测出两株BVDV,命名为BVDV-HT1704、BVDV-HT1723株。通过在MDBK细胞上传代、免疫荧光试验、5’-UTR基因序列测定及分子进化分析对检测出BVDV阳性的肺脏组织进行鉴定。结果显示:在MDBK细胞中盲传10代后没有病变产生;经IFA检测,在病毒感染的细胞浆内产生特异性荧光;序列同源性和系统进化分析表明该毒株属于BVDV-Ⅱa型,且两株分离株属于单一的分支。本研究首次在我国正常牛肺脏组织中分离到BVDV,为了解BVDV在内蒙古自治区的流行情况及地理分布提供依据,并为相关疫苗的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 RT-PCR 分离 鉴定

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猪瘟病毒Erns和E2蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：4

13

作者 张洪亮 郝占武 +6 位作者 林喜平 张志 王凤雪 解倩倩 韩先杰 单虎 温永俊 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第1期76-83,共8页

本研究将CSFV Erns和E2基因的主要抗原区进行克隆,构建pET32a-Erns和pET32aEK-E2重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化,以纯化的rErns、rE2重组蛋白为包被抗原,经条件优化,分别建立CSFV rErns和rE2抗体间接ELISA检测... 本研究将CSFV Erns和E2基因的主要抗原区进行克隆,构建pET32a-Erns和pET32aEK-E2重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化,以纯化的rErns、rE2重组蛋白为包被抗原,经条件优化,分别建立CSFV rErns和rE2抗体间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,分别获得约为47 kDa和42 kDa的重组蛋白,rErns重组蛋白主要在上清液中存在,rE2重组蛋白主要以包涵体形式存在。Western blot结果显示,纯化后的重组蛋白具有良好的免疫原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了Erns蛋白最佳包被量为2.5μg/mL,rE2蛋白最佳包被量为0.625μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为0.25%PVA溶液,HRP标记的兔抗猪IgG二抗最佳稀释度为1∶2000,临界值分别为0.24和0.33。上述方法仅与CSFV阳性血清发生特异性反应,检测敏感性可达到1∶1600,批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%。本研究建立的间接ELISA方法可初步应用于CSFV Erns和E2抗体的检测,鉴别E2亚单位疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,有利于猪瘟净化工作的实施。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 Erns基因 E2基因 蛋白表达 间接ELISA

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牛病毒性腹泻病毒E2基因生物信息学分析及可溶性表达 被引量：1

14

作者 赵洪哲 李新培 +4 位作者 范峻豪 宋前进 张静 关平原 温永俊 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第1期63-67,共5页

为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽... 为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后合成并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Opti-E2;转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经SDS-PAGE和Western blot分析,成功获得大小为43 kDa的BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好。本试验E2蛋白的成功表达可为后续ELISA方法的建立和亚单位疫苗的开发奠定基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 囊膜结构蛋白E2 原核表达

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伪狂犬病病毒gB和gE蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：2

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作者 张洪亮 郝占武 +5 位作者 解倩倩 王凤雪 张志 韩先杰 单虎 温永俊 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第1期98-105,共8页

本研究利用PCR扩增伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株gB基因核心抗原区和闵A株gE基因核心抗原区,构建了重组质粒pET-32a-gB和pET-32a-gE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE分析表明,pET32a-gB蛋白分子... 本研究利用PCR扩增伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株gB基因核心抗原区和闵A株gE基因核心抗原区,构建了重组质粒pET-32a-gB和pET-32a-gE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE分析表明,pET32a-gB蛋白分子量约为44 kDa,pET32a-gE蛋白分子量约为41 kDa。分别以gB和gE重组蛋白作为包被抗原,建立了PRV抗体间接ELISA检测方法。该方法中重组蛋白仅与PRV阳性血清发生特异性反应,检测敏感性可达到1∶1600,批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%。本研究建立的间接ELISA方法可用于PRV抗体的监测,鉴别疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,有利于猪伪狂犬病净化工作。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病病毒 GB基因 GE基因 蛋白表达 间接ELISA

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羊种布鲁氏菌Rev.1株VjbR基因的克隆、原核表达及生物信息学分析 被引量：1

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作者 杭天宇 宋前进 +2 位作者 金铭 关平原 温永俊 《中国动物检疫》 CAS 2019年第12期68-75,共8页

本研究旨在构建表达载体pET-30a-VjbR,进而表达布鲁氏菌VjbR蛋白;利用生物软件分析该蛋白生物信息学信息,为进一步研究该蛋白奠定基础。以布鲁氏菌Rev.1株基因组为模板,扩增VjbR基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质... 本研究旨在构建表达载体pET-30a-VjbR,进而表达布鲁氏菌VjbR蛋白;利用生物软件分析该蛋白生物信息学信息,为进一步研究该蛋白奠定基础。以布鲁氏菌Rev.1株基因组为模板,扩增VjbR基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-30a-VjbR,并进行原核表达、Western-blot检测及该基因的生物信息学分析。结果显示:本试验成功克隆并表达了VjbR基因;经对表达产物进行SDS-PAGE分析纯化,发现本试验得到较纯蛋白;经Western-blot检测,发现该基因表达蛋白可与布鲁氏菌羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性;通过生物信息学系列软件统计分析,发现VjbR蛋白无跨膜区,无信号肽,且该蛋白共有15个抗原决定簇,在二级结构中,α-螺旋的氨基酸有131个,占比为49.81%。布鲁氏菌VjbR基因的成功表达与纯化,为进一步制备该蛋白的单克隆抗体及iELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 VjbR基因 原核表达 免疫原性

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布鲁氏菌eryA基因的克隆、原核表达及生物信息学分析 被引量：1

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作者 宋前进 杭天宇 +3 位作者 乌东高娃 李伊铭 关平原 温永俊 《中国动物检疫》 CAS 2019年第5期61-67,84,共8页

为分析羊种布鲁氏菌Rev.I株的基因结构、功能及作为诊断抗原的可能性,从Rev.I株基因组中扩增eryA基因片段,构建重组质粒pET-30a-eryA并进行原核表达、Western-blot检测,同时对该基因进行生物信息学分析。结果显示:本试验成功克隆并表达... 为分析羊种布鲁氏菌Rev.I株的基因结构、功能及作为诊断抗原的可能性,从Rev.I株基因组中扩增eryA基因片段,构建重组质粒pET-30a-eryA并进行原核表达、Western-blot检测,同时对该基因进行生物信息学分析。结果显示:本试验成功克隆并表达了eryA基因;经Western-blot检测发现,该基因编码蛋白可与阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性;生物信息学分析显示,该蛋白没有跨膜区结构,无信号肽,二级结构中α-螺旋比重最大;抗原表位分析显示:该蛋白含有较多的抗原决定簇。因此,推测eryA蛋白有望作为布鲁氏菌的免疫诊断抗原,这为进一步探索布鲁氏菌基因工程疫苗的研制及iELISA诊断试剂盒的建立奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 eryA基因 原核表达 免疫原性

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犊牛轮状病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用 被引量：1

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作者 韩子阳 赵洋 +8 位作者 唐欣如 张榕兰 冯静萱 王嘉羽 特木尔巴根 郭宇 武娅楠 张志丹 周伟光 《当代畜禽养殖业》 2023年第6期7-12,共6页

为能够现场快速检测出牛场牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV),本试验根据GenBank中BRV NSP5基因序列,针对其保守区域设计了一套RT-LAMP引物,通过对反应体系中Mg2+、dNTPs、内引物的用量以及反应时间和温度进行优化,建立一种能够快速检测... 为能够现场快速检测出牛场牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV),本试验根据GenBank中BRV NSP5基因序列,针对其保守区域设计了一套RT-LAMP引物,通过对反应体系中Mg2+、dNTPs、内引物的用量以及反应时间和温度进行优化,建立一种能够快速检测BRV的反转录-环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法,并验证该方法的特异性、敏感性和重复性,选择出最优检测方法应用于后续临床样品的检验。结果表明:RT-LAMP方法的最佳反应温度为64℃、反应时间为45 min,Mg2+(100 mmol/L)和dNTPs(10 mmol/L)的最佳用量为1.2和1.5μL,内引物最佳用量为2μL;该方法从多种牛腹泻与呼吸道疾病的病原中只检测到BRV,其灵敏度为1×102 copies/μL,而普通RT-PCR的灵敏度为1×103 copies/μL,且重复性高;利用本试验建立的BRV RT-LAMP检测法和普通RT-PCR对38份临床样品进行检测,阳性率分别为47.4%和15.7%。综上所述,本试验建立的RT-LAMP检测方法具有检测速度快、特异性强、灵敏度高和可信度高等优点,且结果易于判定、便于现场检测,在BRV检测方面具有良好的应用前景,为BRV的流行病学调查及检测提供重要的技术支撑。 展开更多

关键词 牛轮状病毒 环介导等温扩增 敏感性 特异性

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塞内卡病毒CH/ZZ/2016株cDNA感染性克隆的构建

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作者 韩宇 王秀明 +5 位作者 刘建奇 刘亭岐 乌吉斯古楞 张斌 宋庆庆 关平原 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第2期67-72,共6页

为构建塞内卡病毒(Senecavirus A)CH/ZZ/2016株的感染性克隆,采用RT-PCR技术分3个cDNA片段对SVA/CH/ZZ/2016株全基因组进行扩增,并克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中。获得重组质粒pSVA-CH/ZZ经NheⅠ、KpnⅠ酶切及测序鉴定后,转染BHK-21... 为构建塞内卡病毒(Senecavirus A)CH/ZZ/2016株的感染性克隆,采用RT-PCR技术分3个cDNA片段对SVA/CH/ZZ/2016株全基因组进行扩增,并克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中。获得重组质粒pSVA-CH/ZZ经NheⅠ、KpnⅠ酶切及测序鉴定后,转染BHK-21细胞并转至PK-15细胞上进行盲传,直至出现细胞病变(CPE)。对出现CPE的细胞上清液进行RT-PCR扩增、酶切、测序、间接免疫荧光试验鉴定。结果显示,成功构建了含SVA全长cDNA克隆的重组质粒,转染BHK-21细胞经PK-15细胞盲传至F5代出现SVA的典型CPE。细胞上清液经RT-PCR扩增、酶切、测序结果表明拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记。间接免疫荧光试验进一步表明拯救了SVA病毒。病毒蚀斑形成和生长曲线表明,拯救毒株和亲本毒株的复制能力及增殖特性相似。本研究构建的CH/ZZ/2016株感染性克隆为进一步研究SVA的致病机理、基因功能及疫苗的研发奠定基础。 展开更多

关键词 塞内卡病毒 全长CDNA 转染 病毒拯救

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