安徽省规模禽场高致病性禽流感血清学横断面研究与风险因素分析 被引量：6

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作者 刘华 占松鹤 +6 位作者 何长生 王倩 杨庆琳 涂健 宋祥军 祁克宗 朱良强 《中国动物检疫》 CAS 2019年第12期1-7,共7页

为掌握安徽省禽群的禽流感免疫抗体水平以及引起免疫不合格的主要风险因素,在2018年春季集中免疫前,对安徽省7个市开展了H5和H7亚型禽流感血清学检测和问卷调查。按照分层随机抽样方法,在7个市选择种禽场、蛋禽场和肉禽场,共140个养禽场... 为掌握安徽省禽群的禽流感免疫抗体水平以及引起免疫不合格的主要风险因素,在2018年春季集中免疫前,对安徽省7个市开展了H5和H7亚型禽流感血清学检测和问卷调查。按照分层随机抽样方法,在7个市选择种禽场、蛋禽场和肉禽场,共140个养禽场,在每个养殖场内随机抽取35份血清样品,进行HI抗体检测,并根据检测结果,计算群体水平的真实免疫合格率/阳性率;将H5或H7亚型禽流感抗体群体合格率低于70%的养禽场定义为免疫不合格场,进行单因素风险分析。结果显示:安徽省7个市H5(Re-8株)和H7N9(Re-1株)的场群真实抗体合格率/阳性率分别为67.7%(95%CI:60.0%~75.4%)和39.8%(95%CI:31.7%~47.9%),62个养禽场的H5或H7亚型抗体未达标(<70%);存栏量越小(P=0.046)、免疫次数越少(P=0.016),H5或H7亚型免疫抗体不合格的可能性越高(P<0.05);存栏量小于4000羽、免疫后时间≤21 d或≥91 d、家禽日龄≤26或≥2200、免疫次数≤1、规模化饲养鹅,以及不使用“H5+H7”二价灭活疫苗(OR=2.66,95%CI:1.34~5.35)、周边3 km内有野禽栖息地(OR=2.78,95%CI:1.10~7.65)的养禽场的H5或H7亚型免疫抗体不合格风险相对较高。结果表明:2018年春季安徽省7个市H5、H7亚型禽流感免疫抗体保护率下降幅度明显,需要及时开展春季集中免疫;养禽场规模、类型以及家禽种类、是否免疫疫苗、免疫次数、养禽场周边是否有野禽栖息地等,均与群体的禽流感免疫抗体合格率显著相关,因此在制定强制免疫计划时,应视情况进行分类指导,实时补免或增加免疫次数。此外,养禽场选址时应尽量避开野禽栖息地。本研究为决策部门制定禽流感免疫方案提供了技术支撑。 展开更多

关键词 高致病性禽流感 H7N9 免疫 风险因素 安徽

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ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌生物学特性及致病性的影响 被引量：3

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作者 邵颖 傅丹丹 +4 位作者 吴晓妍 谷一 宋祥军 涂健 祁克宗 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期3631-3641,共11页

大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2(Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)参与禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的致病作用。本研究旨在探究ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌的生物学特性及致病作用... 大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2(Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)参与禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的致病作用。本研究旨在探究ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌的生物学特性及致病作用的影响,为进一步阐明ETT2的致病机制提供依据。基于CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建epaPQR基因缺失株和回复株,通过生长曲线测定、运动性和生物被膜形成能力等试验,分析epaPQR基因对APEC生物学特性的影响;通过血清杀菌与组织载菌量等试验分析epaPQR基因对APEC致病性的影响。结果表明,成功构建ETT2结构基因epaPQR基因缺失株和回复株,epaPQR基因缺失后,其生长能力和生物被膜形成能力并没有显著改变(P>0.05);但epaPQR基因缺失后,其运动能力显著降低(P<0.05),在透射电镜下观察到缺失株鞭毛数量明显减少,通过荧光定量PCR发现,鞭毛T3SS结构基因及鞭毛输出蛋白基因的转录水平均显著下调(P<0.05)。epaPQR基因缺失后其抗血清杀菌能力显著增强(P<0.05),缺失株AE81ΔepaPQR在雏鸡体内不同器官的定殖能力显著降低。结果说明,ETT2结构基因epaPQR参与调控APEC的鞭毛形成,影响APEC抗血清杀菌能力以及在体内组织器官的定殖能力,表明epaPQR在APEC致病过程中发挥重要作用,本研究为深入探究ETT2功能和APEC致病机制提供参考。 展开更多

关键词 禽致病性大肠杆菌 ETT2 epaPQR基因 生物学特性 致病性

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2015—2017年安徽省定点监测猪群伪狂犬病血清学流行率估计 被引量：3

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作者 刘华 周迎春 +7 位作者 何长生 沈艳 王倩 王军 王维 占松鹤 朱良强 祁克宗 《中国动物检疫》 CAS 2018年第6期22-26,共5页

为了解国家级固定监测点猪群的伪狂犬病流行情况,2015—2017年采用分层随机抽样方法,对安徽省12个固定监测点猪群进行了猪伪狂犬病个体流行率估计,使用猪伪狂犬病病毒g E-ELISA抗体检测试剂盒检测血清样品。结果显示:所调查的12个监测... 为了解国家级固定监测点猪群的伪狂犬病流行情况,2015—2017年采用分层随机抽样方法,对安徽省12个固定监测点猪群进行了猪伪狂犬病个体流行率估计,使用猪伪狂犬病病毒g E-ELISA抗体检测试剂盒检测血清样品。结果显示:所调查的12个监测点猪群的个体真实流行率从2015年的33.6%(95%CI:27.8%~39.5%)降为2016年的1.1%(95%CI:0~4.0%),2017年小幅回升为6.9%(95%CI:3.0%~10.7%);12个监测点中,有8个检出猪伪狂犬病感染抗体,最高的个体表观流行率为77.0%(95%CI:62.9%~91.2%);感染猪场中,种猪群的个体阳性率高于其他猪群;2015年存栏量≥1 000头猪场的个体阳性率较高,感染风险是<1 000头猪场的2.0倍(95%CI:1.0~3.8),而2017年却相反,存栏量≥1 000头猪场的感染风险是<1 000头猪场的20%(95%CI:0.1~0.5)。结果表明:安徽省定点监测猪群的伪狂犬病感染面依然较广,但流行程度呈下降趋势;种猪群和小规模饲养猪群是当前猪伪狂犬病防控的重点。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病 gE-ELISA 定点监测 流行率

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2019年安徽省A型禽流感病毒群体流行率横断面研究

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作者 刘华 何长生 +7 位作者 苗文萍 王维 王倩 王军 周迎春 沈艳 占松鹤 朱良强 《中国动物检疫》 CAS 2021年第8期8-12,共5页

为掌握安徽省A型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染情况,2019年春季和秋季开展了两次横断面研究。用估计流行率方法,每次随机选取包括种禽场、蛋禽场、肉禽场、活禽批发市场、农贸市场、自然村和野禽栖息地在内的约193个场点,... 为掌握安徽省A型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染情况,2019年春季和秋季开展了两次横断面研究。用估计流行率方法,每次随机选取包括种禽场、蛋禽场、肉禽场、活禽批发市场、农贸市场、自然村和野禽栖息地在内的约193个场点,再用发现疫病抽样策略,在每个场点采集20份家禽咽喉-泄殖腔双拭子、环境拭子或野禽粪便棉拭子样品,使用荧光RT-PCR检测试剂盒进行A型AIV核酸检测,对检测阳性的再进行H5、H7和H9亚型分型。结果显示:春、秋两季AIV群体表观流行率分别为17.9%、12.6%,群体真实流行率分别为16.4%(95%CI:11.2%~21.6%)、10.4%(95%CI:6.1%~14.7%);春、秋两季在规模养殖场、自然村散养户、活禽批发市场和农贸市场均检出了A型AIV,其中H9亚型阳性率分别为6.2%、4.2%,未检出H5、H7亚型;A型AIV流行率无地理和季节上的显著差异(P> 0.05),但春、秋两季的活禽市场流行率比(prevalence ratio,PR)分别是养禽场的2.2倍(95%CI:1.2~4.2)、2.3倍(95%CI:1.1~5.0)。结果表明,2019年春、秋两季A型AIV在安徽省养殖和交易环节均存在不同程度的污染,其中交易环节流行风险较大,因此要特别注重活禽交易市场和农贸市场的禽流感防控。 展开更多

关键词 禽流感 流行率 横断面研究 种禽场 商品蛋禽场 商品肉禽场 活禽交易市场

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Ⅵ型分泌系统分泌蛋白ClpV对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响 被引量：6

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作者 连丽燕 宋祥军 +4 位作者 蒋胡艳 陈兆国 蒋蔚 韩先干 祁克宗 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期848-853,共6页

为研究clpV对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组构建了APEC DE17株的clpV缺失株DE17ΔclpV及其回补株DE17CΔclpV,比较分析了野生株、缺失株和回补株的生长曲线,运动性和生物被膜(BF)形成能力;对DF-1细胞... 为研究clpV对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组构建了APEC DE17株的clpV缺失株DE17ΔclpV及其回补株DE17CΔclpV,比较分析了野生株、缺失株和回补株的生长曲线,运动性和生物被膜(BF)形成能力;对DF-1细胞的黏附、侵入能力以及通过荧光定量PCR检测clpV缺失后对Ⅵ型分泌系统(T6SS)相关基因转录水平的影响。结果显示,通过Red同源重组构建了clpV基因缺失株与回补株,利用分光光度计测OD600nm绘制野生株、缺失株和回补株的生长曲线。结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV生长速率无明显变化;其运动和BF形成能力的检测结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV的运动能力降低(p<0.05),而其BF形成能力则升高(p<0.05);分别将DE17、DE17ΔclpV和DE17ΔclpV感染DF-1细胞,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV对DF-1细胞的黏附能力升高(p<0.01),而侵入能力减弱(p<0.01)。荧光定量检测结果显示,与野生株相比,clpV缺失株csgD、icmF、lip和hcp基因的转录水平升高(p<0.05),而vgrG和rpoD基因的转录水平降低(p<0.05)。本研究结果表明,T6SS的分子伴侣ClpV影响APEC的生物学特性,为进一步研究T6SS的功能及其致病机制提供参考。 展开更多

关键词 禽致病性大肠杆菌 Ⅵ型分泌系统 clpV基因 生物学功能

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OmpT对禽致病性大肠杆菌生物学特性和致病性影响的研究 被引量：2

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作者 宋祥军 蒋胡艳 +4 位作者 侯曼曼 涂健 邵颖 刘红梅 祁克宗 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1009-1014,1020,共7页

为研究OmpT对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,本实验通过Red同源重组方法构建了APEC AE17菌株omp T缺失株(ΔompT)及回复株(ΔompT-comp),检测ompT基因缺失后对APEC生长速率、运动性、抗吞噬能力、组织载菌量、致病力... 为研究OmpT对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,本实验通过Red同源重组方法构建了APEC AE17菌株omp T缺失株(ΔompT)及回复株(ΔompT-comp),检测ompT基因缺失后对APEC生长速率、运动性、抗吞噬能力、组织载菌量、致病力以及基因表达量的影响。实验结果显示:ΔompT在生长速率、运动性及抗巨噬细胞吞噬方面与野生株相比差异不显著;其在雏鸡肝脏、脾脏、肺脏的载菌量均下降;LD50试验结果显示缺失株的致病力下降10倍。RNA-Seq分析结果显示ΔompT与野生株相比差异表达的基因共有490个,其中有365个基因表达上调,125个基因表达下调;生物信息学分析结果显示差异基因富集ABC转运通路、鞭毛装配以及脂多糖生物合成等重要通路。本研究发现ompT基因缺失后引起细菌基因表达量变化,并且导致APEC的致病性降低,该研究结果为APEC致病机理的研究提供了参考依据。 展开更多

关键词 禽致病性大肠杆菌 OMPT 生物学特性 致病性

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禽致病性大肠杆菌ETT2转录因子eivF缺失株的生物学特性及转录组学分析 被引量：2

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作者 傅丹丹 肖亚婷 +6 位作者 薛媚 Muhammad Akmal Raheem 冯寒霜 涂健 宋祥军 邵颖 祁克宗 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2020年第8期28-36,共9页

【目的】构建禽致病性大肠杆菌(APEC)Ⅲ型分泌系统2(ETT2)转录因子eivF缺失株,并对其进行生物学特性及转录组学分析,探究转录因子eivF基因在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建... 【目的】构建禽致病性大肠杆菌(APEC)Ⅲ型分泌系统2(ETT2)转录因子eivF缺失株,并对其进行生物学特性及转录组学分析,探究转录因子eivF基因在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建APEC ETT2转录因子eivF基因缺失的APEC AE81△eivF株及其回复株AE81 C-eivF,通过运动性、生物被膜形成等试验分析eivF对APEC生物学功能的影响;并利用转录组学方法分析eivF在转录调控网络中对细菌鞭毛和生物被膜等相关因子的转录调控作用。【结果】成功构建了APEC eivF基因缺失株AE81△eivF和回复株AE81 C-eivF;生物学结果表明,与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF运动能力降低,生物被膜形成褶皱堆砌且厚度增大,空间结构呈立体、多层次状,并形成类似于三维塔状结构的突起,回复株AE81 C-eivF运动能力和生物被膜形成能力基本恢复;与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF有576个基因差异表达,且鞭毛和生物被膜等相关基因在转录水平上均发生显著变化。【结论】ETT2的转录因子eivF参与调控APEC的生物表型变化,其可能通过调控鞭毛、生物被膜相关基因而调控APEC致病过程。 展开更多

关键词 禽致病性大肠杆菌 ETT2分泌系统 转录因子eivF

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羊口疮病毒安徽株121基因的原核表达与生物信息学分析

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作者 刘自敏 王小朋 +5 位作者 白彩霞 杨侃侃 张学琪 胡子慧 孙裴 王勇 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2019年第S01期358-365,共8页

为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E.... 为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8.86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62.25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27.81%,2.98%,6.95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 121基因 原核表达 生物信息学

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hipA对禽致病性大肠杆菌生物学特性和致病性的影响

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作者 吴晓妍 吴剑梅 +4 位作者 傅丹丹 涂健 宋祥军 邵颖 祁克宗 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2023年第8期11-18,28,共9页

【目的】探究毒素-抗毒素(TA)系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE8... 【目的】探究毒素-抗毒素(TA)系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE81ΔhipA及回复株C-AE81ΔhipA,测定其生长曲线、运动性、环境耐受能力、细胞黏附能力,并采用实时荧光定量PCR检测环境耐受相关基因(hdeA、hdeB)、黏附相关基因(fimF、fimH)、毒力相关基因(hcp、ompR、ompC)的转录水平,探究毒素蛋白hipA对APEC的生物学功能及致病性的影响。【结果】成功构建hipA基因的缺失株和回复株。野生株AE81、缺失株AE81ΔhipA和回复株C-AE81ΔhipA的生长情况无明显差异。与野生株AE81相比,hipA基因缺失株AE81ΔhipA的运动能力降低,对酸性、碱性、高渗和氧化应激环境的耐受能力减弱,鞭毛和菌毛的数量和长度明显减小,对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的黏附能力极显著减弱(P<0.01),回复株C-AE81ΔhipA各指标基本恢复到野生株水平。实时荧光定量PCR结果显示,与野生株AE81相比,AE81ΔhipA菌株的hdeA、hdeB、fimF、ompR、ompC基因转录水平显著降低(P<0.05),hcp基因转录水平差异不显著,但fimH转录水平显著升高(P<0.05)。【结论】TA系统毒素蛋白hipA影响APEC的运动性、环境耐受能力和对细胞的黏附能力,参与APEC的致病过程。 展开更多

关键词 禽致病性大肠杆菌 毒素-抗毒素系统 hipA基因

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猪圆环病毒3型LAMP-PfAgo检测方法的建立

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作者 祁钊 余相宇 +1 位作者 陈魏圆 宋祥军 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第2期1-9,31,共10页

【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守... 【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守区域设计PCV3-T1~PCV3-T4等4组引物(每组包括1对内引物和1对外引物),以pMD19-T-PCV3-Rep为模板进行LAMP,筛选最佳引物组,并对LAMP反应的Mg ^(2+)浓度、内外引物浓度、反应温度、反应时间进行优化。根据PCV3 Rep基因的保守序列,设计PCV3-gs1~PCV3-gs5等5组gDNAs和一条特异性探针,进行LAMP-PfAgo反应,筛选最佳的gDNAs,并对LAMP-PfAgo反应体系中PfAgo蛋白浓度、gDNAs浓度、Mn 2+浓度和反应时间进行优化。对该LAMP-PfAgo方法的特异性、敏感性进行评价;并用该方法和实时荧光定量PCR方法对疑似感染PCV3的46份临床样品进行检测,比较结果的一致性。【结果】重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep PCR和测序均获得了891 bp的序列,表明重组阳性质粒构建成功。LAMP最佳引物为PCV3-T1,最佳Mg ^(2+)终浓度为6 mmol/L,最佳内外引物终浓度分别为1.6和1.2μmol/L,最适的反应温度65℃,最佳反应时间60 min。使用优化后的LAMP反应条件对PCV3 Rep基因保守序列进行扩增,并将其用于后续试验。LAMP-PfAgo反应最佳的gDNAs为PCV3-gs1;优化后的PfAgo蛋白终浓度为40 U/μL,gDNAs终浓度为1.50μmol/L,Mn 2+终浓度为1.50 mmol/L,反应时间为30 min。LAMP-PfAgo法的灵敏度为10拷贝/μL,且与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病毒等常见猪源病原核酸无交叉反应。临床样本检测结果显示,LAMP-PfAgo法与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合率为100%。【结论】基于PfAgo蛋白结合LAMP技术建立了对PCV3的核酸检测方法,该方法灵敏度高和特异性强,具有潜在的临床应用价值。 展开更多

关键词 猪圆环病毒3型 PfAgo 环介导等温扩增 即时检验 猪

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禽4型腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

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作者 张宇 程凡玉 +7 位作者 俞赵荣 邵颖 魏宁波 陈芳芳 王振宇 宋祥军 涂健 祁克宗 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第5期2364-2371,共8页

本研究旨在制备禽4型腺病毒(fowl adenovirus type 4,FAdV-4)的单克隆抗体,鉴定其特异性结合位点,并评估其在免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫沉淀反应中的应用价值。使用纯化的FAdV-4-AH-F41株全病毒免疫小鼠,通过间接酶联免... 本研究旨在制备禽4型腺病毒(fowl adenovirus type 4,FAdV-4)的单克隆抗体,鉴定其特异性结合位点,并评估其在免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫沉淀反应中的应用价值。使用纯化的FAdV-4-AH-F41株全病毒免疫小鼠,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法筛选出一株阳性杂交瘤细胞并进行亚克隆,并对所制备的单克隆抗体进行效价检测。利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)与蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定单克隆抗体生物学特性,构建了pCold TF-Hexon、pET-32a(+)-Fiber1、pCold TF-Penton、pCold TF-Fiber2的原核表达载体,并通过Western blot初步鉴定所得单克隆抗体的特异性结合位点,在检测出抗体的亚型后,将其初步应用于IHC和免疫沉淀试验。结果表明本试验获得1株稳定分泌抗Fiber1蛋白的单克隆抗体,并将其命名为5C7。该抗体效价为1∶102400,亚型为IgG-2b,表现出良好的生物学特性。在IHC中,能够观察到明显的病变特征;在免疫沉淀试验中,5C7可作为捕获抗体,与病毒感染细胞中的Fiber1蛋白特异性结合。结果提示,本试验通过全病毒粒子免疫小鼠所制备的单克隆抗体能够特异性识别Fiber1蛋白,并在IHC和免疫沉淀反应中显示出良好的应用前景,为FAdV-4实验室病理诊断方法的建立和Fiber1蛋白的功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 血清4型禽腺病毒 单克隆抗体 抗体鉴定 Fiber1蛋白 IHC 免疫共沉淀

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RyhB-cysE基因对禽致病性大肠杆菌生物表型的影响 被引量：1

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作者 涂健 阮苑 +3 位作者 蔡伟真 宋祥军 邵颖 祁克宗 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第5期1247-1254,共8页

在禽致病性大肠杆菌(APEC)AE17及AE17△RyhB的基础上利用Red同源重组技术构建基因缺失株AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE,对野生株和基因缺失株的生长、生物被膜形成和运动特性进行分析,并采用qRT-PCR技术比较野生株和缺失株中与运动性、... 在禽致病性大肠杆菌(APEC)AE17及AE17△RyhB的基础上利用Red同源重组技术构建基因缺失株AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE,对野生株和基因缺失株的生长、生物被膜形成和运动特性进行分析,并采用qRT-PCR技术比较野生株和缺失株中与运动性、生物被膜形成相关基因的转录水平。结果显示,各菌株生长曲线无显著差异;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力较AE17显著下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE运动能力与AE17相比下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比flhB、flgD、fliF和cheY转录水平均降低,而AE17△RyhB△cysE与AE17△cysE相比基因转录水平均有所增强;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比,flhD、flgC、sidA转录水平均显著降低。表明cysE基因缺失降低了APEC生物被膜形成能力及运动能力,且RyhB基因缺失对cysE基因的运动能力调控作用有代偿作用,RyhB、cysE基因均通过调节与生物被膜形成相关的基因(flhD、flgC、sidA)转录水平调控APEC生物被膜形成能力,本研究结果为研究RyhB-cysE基因对APEC的调控作用奠定了基础。 展开更多

关键词 禽致病性大肠杆菌 RyhB基因 cysE基因 生物被膜 运动性

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ChemRB:基于双向分子环约束的新型生成模型

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作者 王庆勇 唐良贵 +1 位作者 王振宇 辜丽川 《陕西师范大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期45-59,共15页

在药物发现的早期阶段,深度生成模型正逐渐成为分子设计的关键工具。简化分子线输入系统(simplified moleaclar input line entry system,SMILES)作为标准的化学表示法,被广泛用于模型训练与生成。然而,由于分子环系统线性表示的非唯一... 在药物发现的早期阶段,深度生成模型正逐渐成为分子设计的关键工具。简化分子线输入系统(simplified moleaclar input line entry system,SMILES)作为标准的化学表示法,被广泛用于模型训练与生成。然而,由于分子环系统线性表示的非唯一性和非方向性,现有的单向编码器在捕捉样本全局语义结构和生成有效分子环时存在局限性。因此,提出一种名为Chemical RWKV BERT(ChemRB)的方法,旨在从海量的未标记数据中深度挖掘双向信息。为实现这一目标,创新性地设计了2个预训练任务:环级特征预测与全局跨度闭合预测。这些预训练任务不仅为模型提供了丰富多元的上下文信息,更进一步提升了其对复杂分子结构特性的深入理解。实验结果显示:ChemRB模型不仅在性能上取得了显著提升,而且在新分子/样本的评估指标上也达到了最优的基准性能。结果充分验证了ChemRB在精准捕获分子固有结构信息方面的有效性,为其在相关领域的应用提供了坚实的实证基础。最后,通过在EGFR抑制剂上的测试和应用,进一步验证了ChemRB模型的实用性和广泛应用前景。 展开更多

关键词 分子建模 分子生成 分子环系统 SMILES 深度学习

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T6SS效应蛋白Tse1的原核表达及其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

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作者 张曼琪 赵冰雨 +5 位作者 温如如 张静雯 孙孟冉 占乐杨 苟婧萱 宋祥军 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2917-2926,共10页

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion systems,T6SS)广泛存在于革兰阴性菌中,其效应蛋白Tse1在细菌种间竞争中发挥着重要的作用。本研究旨在探究Tse1对金黄色葡萄球菌(Staphylococcu saureus,S.aureus)的抑菌作用,探索其在耐药性细菌中的表现... Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion systems,T6SS)广泛存在于革兰阴性菌中,其效应蛋白Tse1在细菌种间竞争中发挥着重要的作用。本研究旨在探究Tse1对金黄色葡萄球菌(Staphylococcu saureus,S.aureus)的抑菌作用,探索其在耐药性细菌中的表现和影响。利用含有重组质粒pET-28a-Tse1的大肠杆菌原核表达系统诱导Tse1蛋白表达并纯化。通过荧光显微镜及扫描电镜观察重组蛋白Tse1对金黄色葡萄球菌细胞壁的破坏作用。最后,采用琼脂孔扩散抑菌试验、微量肉汤稀释法测定重组蛋白Tse1对金黄色葡萄球菌的抗菌活性及其与抗生素联合作用的效果。结果表明,在16℃,IPTG浓度为0.5 mmol·L^(-1)诱导16 h时,Tse1蛋白的表达量达到最高并以可溶性形式存在于上清液中,蛋白相对分子质量约为22 ku。重组蛋白Tse1与S.aureus共培后可发现蛋白结合在菌体表面并能破坏其细胞壁,破坏程度表现为剂量依赖形式。琼脂孔扩散抑菌试验表明重组蛋白Tse1对S.aureus不同菌株均有明显抑菌作用,并且与青霉素(PG)联合使用能明显提升Tse1蛋白的抑菌效果。本试验建立了Tse1蛋白的原核表达及纯化方法,证明了Tse1蛋白对金黄色葡萄球菌具有抑菌作用,与青霉素联合应用能增强其抑菌效果,为挖掘新型抗生素替代品提供了相关理论基础。 展开更多

关键词 抗生素替代 Ⅵ型分泌系统 Tse1 金黄色葡萄球菌

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Ⅲ型分泌系统2转录因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜调控机制的研究 被引量：2

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作者 肖亚婷 傅丹丹 +6 位作者 MUHAMMAD AKMAL RAHEEM 薛媚 谷一 涂健 宋祥军 邵颖 祁克宗 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期2488-2497,共10页

生物被膜是导致细菌产生耐药性的主要原因之一,本文通过探究Ⅲ型分泌系统2(ETT2)转录调节因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成的影响及其影响机制,为探究ETT2对禽致病性大肠杆菌致病机制的影响提供研究基础。利用Red同源重组的方法... 生物被膜是导致细菌产生耐药性的主要原因之一,本文通过探究Ⅲ型分泌系统2(ETT2)转录调节因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成的影响及其影响机制,为探究ETT2对禽致病性大肠杆菌致病机制的影响提供研究基础。利用Red同源重组的方法构建yqeI基因缺失株,并通过检测野生株与缺失株生物被膜形成能力、结合转录组学测序及荧光定量检测生物被膜基因表达量等,探究转录调节因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成能力的影响。结果显示成功构建了yqeI基因缺失株,且yqeI的缺失并不影响生长曲线,但生物被膜形成能力显著下降,且相关生物被膜基因转录量显著下调。禽致病性大肠杆菌ETT2转录调节因子YqeI显著影响了禽致病性大肠杆菌生物被膜形成能力,为从ETT2及yqeI的角度发掘潜在的调控网络提供依据。 展开更多

关键词 禽致病性大肠杆菌 Ⅲ型分泌系统2 转录因子YqeI 生物被膜

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组氨酸激酶基因envZ调控禽致病性大肠埃希菌生物被膜的机制研究 被引量：1

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作者 冯寒霜 薛媚 +5 位作者 卢会奇 谷一 邵颖 宋祥军 涂健 祁克宗 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期26-33,共8页

【目的】研究双组分系统ompR/envZ中的组氨酸激酶基因envZ对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物被膜形成能力的影响,了解该双组分系统在APEC中对生物被膜的调控机制,为探索生物被膜影响禽致病性大埃希菌... 【目的】研究双组分系统ompR/envZ中的组氨酸激酶基因envZ对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物被膜形成能力的影响,了解该双组分系统在APEC中对生物被膜的调控机制,为探索生物被膜影响禽致病性大埃希菌耐药性的途径提供参考。【方法】采用Red同源重组的方法构建envZ基因缺失株,比较野生株和envZ基因缺失株生长特性、生物被膜形成能力的差异。利用转录组学方法分析envZ在转录调控网络中对其生物被膜形成相关基因的调控机制。【结果】成功构建envZ基因缺失株AE17ΔenvZ;envZ基因缺失对APEC的生长速度无明显影响,但使APEC生物被膜的成膜能力减弱。与野生株AE17相比,envZ基因缺失株有711个基因发生差异表达,与生物被膜形成相关的基因显著下调。【结论】envZ基因除了响应环境渗透压,还参与调控APEC生物被膜的形成。 展开更多

关键词 禽致病性大肠埃希菌 envZ基因 生物被膜 转录组分析

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禽致病性大肠杆菌生物被膜形成能力及相关特性分析 被引量：9

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作者 邓小玲 孙影 +5 位作者 尤向峰 吴育发 王梦云 胡积东 王有为 阮祥春 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期918-926,共9页

[目的]本研究旨在分析能形成生物被膜的临床分离禽致病性大肠杆菌(APEC)菌株的生物学特征。[方法]用刚果红平板法对70株APEC进行筛选,并用结晶紫染色法鉴定菌株生物被膜的形成能力;通过测定不同时间生物被膜生长情况,推断菌株的膜成熟时... [目的]本研究旨在分析能形成生物被膜的临床分离禽致病性大肠杆菌(APEC)菌株的生物学特征。[方法]用刚果红平板法对70株APEC进行筛选,并用结晶紫染色法鉴定菌株生物被膜的形成能力;通过测定不同时间生物被膜生长情况,推断菌株的膜成熟时间;依据玻璃试管法判断菌株是否有卷曲菌毛以及形成生物被膜基质中是否含有胞外纤维素,同时用苯酚-硫酸法测定膜基质中胞外多糖的浓度。对与生物被膜形成相关群体感应系统、菌毛、鞭毛、蛋白、多糖的基因进行PCR检测,最后通过最小抑菌浓度法检测形成生物被膜的菌株对10种抗菌药的耐药性并分析它们的耐药特性。[结果]在鉴定出能形成生物被膜的31株菌中,强、中等和弱成膜能力的分别有10、7和14株。强成膜菌株膜成熟时间比弱成膜菌株的短且差异显著(P<0.05),但与中等成膜菌株膜成熟时间差异不显著(P>0.05)。强成膜能力的菌株中含有菌毛和产生胞外纤维素的菌株所占的比例最高,且胞外多糖含量极显著高于中等和弱成膜菌株(P<0.01)。生物被膜相关基因的检测结果显示,群体感应系统相关基因检出率最高,达到100.00%,其他从高到低依次为菌毛、蛋白、鞭毛、多糖相关基因。耐药性测定结果表明,生物被膜阳性菌株对10种抗菌药有不同程度的耐药性,且成膜能力越强,对10种抗菌药的耐药程度越严重。[结论]强成膜能力菌株的膜成熟时间短,产生膜基质的量多、组成更复杂,且对10种抗菌药的耐药程度更严重。 展开更多

关键词 生物被膜 禽致病性大肠杆菌 生物学特征 抗菌药 耐药性

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禽腺病毒流行株FAdV-4-AH-F41的分子特征及对细胞因子的诱导作用 被引量：1

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作者 魏宁波 刘琪 +6 位作者 徐良 杨侃侃 曹影丽 宋祥军 邵颖 涂健 祁克宗 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2024年第4期10-20,27,共12页

【目的】分析1株血清4型禽腺病毒(FAdV-4)流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水-肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞(LMH)对病原进行分离,采用PCR、透射电镜(TEM)观察和间接免... 【目的】分析1株血清4型禽腺病毒(FAdV-4)流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水-肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞(LMH)对病原进行分离,采用PCR、透射电镜(TEM)观察和间接免疫荧光试验(IFA)对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体(SPF)鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸(cGAS)、干扰素刺激因子(STING)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、干扰素调节因子7(IRF7)、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70~90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列(43708 bp);遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30453-30674 bp,第2个发生在36884-36988 bp,第3个发生在43401-43715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照(DMEM/F12处理)相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中cGAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ-β差异达极显著水平(P<0.01),IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平(P<0.05),STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。 展开更多

关键词 禽腺病毒4型 鸡肝癌细胞 致病性 细胞因子

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T6SS效应蛋白Tae4对金黄色葡萄球菌和产单核细胞李氏杆菌的抑菌作用

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作者 占乐杨 苟婧萱 +6 位作者 张曼琪 傅唯轩 兰守信 涂健 王振宇 邵颖 宋祥军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4660-4669,共10页

旨在探究Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretion systems,T6SS)的毒力效应蛋白Tae4酰胺酶对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)及产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)的抑菌作用。将pET-28a-Tae4重组质粒... 旨在探究Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretion systems,T6SS)的毒力效应蛋白Tae4酰胺酶对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)及产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)的抑菌作用。将pET-28a-Tae4重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(Escherichia coli BL21,E.coli BL21)进行目的蛋白诱导表达,优化IPTG的诱导时间、浓度、温度,最后纯化后的Tae4蛋白通过琼脂孔扩散试验、最小抑菌浓度测定、抗生素联用抑菌试验分别作用于S.aureus和L.monocytogenes。SDS-PAGE电泳结果显示,本试验中重组蛋白诱导表达最佳条件为:IPTG终浓度为0.5 mmol·L^(-1),16℃诱导16 h。重组蛋白大小约为21 ku,可溶性表达于培养上清中。琼脂孔扩散试验结果显示,Tae4蛋白浓度500μg·mL^(-1)时S.aureus菌株均出现13mm以上抑菌圈,效果与菌株血清型有关,L.monocytogenes菌株均出现18mm以上抑菌圈;最小抑菌浓度试验结果显示,Tae4蛋白对S.aureus的MIC约为250μg·mL^(-1),对L.monocytogenes的MIC约为125μg·mL^(-1),点板法和微量肉汤稀释法结果一致;抗生素联用抑菌试验结果显示,Tae4蛋白与青霉素(penicillin,PG)联合使用均比单独使用的抑菌效果要好,且对L.monocytogenes的抑菌效果优于S.aureus。综上,Tae4蛋白对金黄色葡萄球菌和产单核细胞李氏杆菌具有抑菌效果,与青霉素联用抑菌效果得到了增强,为后续抗生素替代提供理论依据。 展开更多

关键词 Tae4 Ⅵ型分泌系统 金黄色葡萄球菌 产单核细胞李氏杆菌 抗生素替代

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抗羊口疮病毒囊膜蛋白B2L小鼠多克隆抗体的制备和应用 被引量：9

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作者 周祺 顾香雪 +8 位作者 许泽军 黄荣 黄军生 李浩然 李涛 周晓雅 苏观志 殷冬冬 王桂军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期1036-1040,共5页

目的获取羊口疮病毒(ORFV)囊膜蛋白B2L并制备鼠抗B2L蛋白多克隆抗体。方法采用PCR扩增获得B2L基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a和真核表达载体p3×FLAG-CMV-14。两个重组表达载体均经过鉴定,重组原核表达载体使用BL21大... 目的获取羊口疮病毒(ORFV)囊膜蛋白B2L并制备鼠抗B2L蛋白多克隆抗体。方法采用PCR扩增获得B2L基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a和真核表达载体p3×FLAG-CMV-14。两个重组表达载体均经过鉴定,重组原核表达载体使用BL21大肠杆菌表达,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白。通过Tris-尿素溶液洗去非目的蛋白,Western blot法鉴定。将定量的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗ORFV B2L多克隆抗体。将真核表达重组质粒p3×FLAG-B2L转染Vero细胞、BHK-21细胞,使用间接免疫荧光法(IFA)对抗B2L蛋白的多克隆抗体鉴定,并应用于免疫组织化学染色检测患病羊唇部组织ORFV的表达。结果 Western blot法确定了制备的B2L蛋白的特异性; IFA结果表明制备的小鼠抗B2L多克隆抗体有特异性和反应原性,免疫组织化学染色法结果表明该抗体可以检测出患病羊唇部组织的ORFV。结论成功制备了特异性的小鼠抗B2L多克隆抗体。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 B2L 多克隆抗体

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