目的:探讨Mettl3介导m^(6)A甲基化修饰对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的脊髓神经元氧化应激和调亡的影响。方法:分离新生(24h内)SD大鼠脊髓,经消化、离心后重悬沉淀,差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中,经免疫荧光鉴...目的:探讨Mettl3介导m^(6)A甲基化修饰对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的脊髓神经元氧化应激和调亡的影响。方法:分离新生(24h内)SD大鼠脊髓,经消化、离心后重悬沉淀,差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中,经免疫荧光鉴定呈β3-tubulin阳性,确认为脊髓神经元。将脊髓神经元随机分为6组:空白组,细胞不予任何处理,正常培养;转染对照组,细胞转染阴性对照siRNA(si-NC);转染组,细胞转染Mettl3 siRNA(si-Mettl3);诱导组,细胞采用300μmol/L的H_(2)O_(2)处理;转染对照诱导组,细胞先转染si-NC,然后采用300μmol/LH_(2)O_(2)处理;转染诱导组,细胞先转染si-Mettl3,然后采用300μmol/LH_(2)O_(2)处理。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞Mettl3的mRNA表达水平,Westernblot检测Mettl3、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平,免疫荧光检测Mettl3表达,酶标仪检测各组整体m^(6)A水平,并检测白细胞介素IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:与空白组相比,诱导组的m6A甲基化修饰水平显著提高(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),IL-1β(73.39±8.82ng/Lvs125.58±15.31ng/L)、IL-6(63.34±7.12ng/L vs 101.28±12.49ng/L)、TNF-α(103.29±12.19ng/Lvs 204.37±23.65ng/L)和MDA(4.01±0.67pmol/Lvs 9.23±1.05pmol/L)水平显著性升高(P<0.05),SOD(28.37±3.72U/mgvs 17.23±2.05U/mg)和GSHPx(158.19±19.26U/mgvs83.35±9.05U/mg)水平显著性降低(P<0.05),且Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),细胞凋亡率显著升高[(8.30±0.68)%vs(34.29±3.16)%,P<0.05];与诱导组相比,转染诱导组的m^(6)A甲基化修饰水平显著性降低(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),IL-1β(125.58±15.31ng/L vs 96.28±11.27ng/L)、IL-6(101.28±12.49ng/L vs 84.56±10.24ng/L)、TNF-α(204.37±23.65ng/L vs 147.15±18.46ng/L)和MDA(9.23±1.05pmol/L vs 7.28±0.96pmol/L)水平显著性降低(P<0.05),SOD(17.23±2.05U/mg vs 24.01±2.76U/mg)和GSH-Px(83.35±9.05U/mg vs 121.48±15.47U/mg)水平显著升高(P<0.05),且Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),细胞凋亡率显著性降低(34.29±3.16)%vs(23.57±2.01)%,P<0.05)。与空白组相比,转染组的炎性因子、氧化应激和调亡水平均无显著性差异(P>0.05)。结论:H_(2)O_(2)可上调脊髓神经元中m^(6)A甲基化修饰水平,并可诱导氧化应激和细胞凋亡;抑制Mettl3表达能够降低H_(2)O_(2)诱导的脊髓神经元m^(6)A甲基化修饰水平,进而缓解氧化应激和细胞凋亡。展开更多
文摘目的:探讨Mettl3介导m^(6)A甲基化修饰对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的脊髓神经元氧化应激和调亡的影响。方法:分离新生(24h内)SD大鼠脊髓,经消化、离心后重悬沉淀,差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中,经免疫荧光鉴定呈β3-tubulin阳性,确认为脊髓神经元。将脊髓神经元随机分为6组:空白组,细胞不予任何处理,正常培养;转染对照组,细胞转染阴性对照siRNA(si-NC);转染组,细胞转染Mettl3 siRNA(si-Mettl3);诱导组,细胞采用300μmol/L的H_(2)O_(2)处理;转染对照诱导组,细胞先转染si-NC,然后采用300μmol/LH_(2)O_(2)处理;转染诱导组,细胞先转染si-Mettl3,然后采用300μmol/LH_(2)O_(2)处理。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞Mettl3的mRNA表达水平,Westernblot检测Mettl3、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平,免疫荧光检测Mettl3表达,酶标仪检测各组整体m^(6)A水平,并检测白细胞介素IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:与空白组相比,诱导组的m6A甲基化修饰水平显著提高(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),IL-1β(73.39±8.82ng/Lvs125.58±15.31ng/L)、IL-6(63.34±7.12ng/L vs 101.28±12.49ng/L)、TNF-α(103.29±12.19ng/Lvs 204.37±23.65ng/L)和MDA(4.01±0.67pmol/Lvs 9.23±1.05pmol/L)水平显著性升高(P<0.05),SOD(28.37±3.72U/mgvs 17.23±2.05U/mg)和GSHPx(158.19±19.26U/mgvs83.35±9.05U/mg)水平显著性降低(P<0.05),且Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),细胞凋亡率显著升高[(8.30±0.68)%vs(34.29±3.16)%,P<0.05];与诱导组相比,转染诱导组的m^(6)A甲基化修饰水平显著性降低(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),IL-1β(125.58±15.31ng/L vs 96.28±11.27ng/L)、IL-6(101.28±12.49ng/L vs 84.56±10.24ng/L)、TNF-α(204.37±23.65ng/L vs 147.15±18.46ng/L)和MDA(9.23±1.05pmol/L vs 7.28±0.96pmol/L)水平显著性降低(P<0.05),SOD(17.23±2.05U/mg vs 24.01±2.76U/mg)和GSH-Px(83.35±9.05U/mg vs 121.48±15.47U/mg)水平显著升高(P<0.05),且Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),细胞凋亡率显著性降低(34.29±3.16)%vs(23.57±2.01)%,P<0.05)。与空白组相比,转染组的炎性因子、氧化应激和调亡水平均无显著性差异(P>0.05)。结论:H_(2)O_(2)可上调脊髓神经元中m^(6)A甲基化修饰水平,并可诱导氧化应激和细胞凋亡;抑制Mettl3表达能够降低H_(2)O_(2)诱导的脊髓神经元m^(6)A甲基化修饰水平,进而缓解氧化应激和细胞凋亡。
