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抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠中的药效学研究 被引量：2
1
作者 李秀梅 陈阳述 +4 位作者 刘光泽 黎经纬 陈媚娟 周军辉 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期893-896,共4页
目的研究抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠体内的药效学作用。方法 SPF级TgM(HBV D1.3)小鼠分为Bay41-4109组[30mg/(kg.d)],拉米夫定组[30mg/(kg.d)]和溶媒组(0.5%羧甲基纤维素钠)3组,每组32只。利用免疫组化分析HBV转基因小鼠... 目的研究抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠体内的药效学作用。方法 SPF级TgM(HBV D1.3)小鼠分为Bay41-4109组[30mg/(kg.d)],拉米夫定组[30mg/(kg.d)]和溶媒组(0.5%羧甲基纤维素钠)3组,每组32只。利用免疫组化分析HBV转基因小鼠肝组织HBcAg变化,定量PCR技术研究HBV转基因小鼠肝组织HBV DNA及血清HBV DNA的变化,并从血清转氨酶及体重指标分析该药物体内作用的安全性。结果给药第50天,Bay41-4109组HBcAg阳性细胞核个数、阳性细胞核平均面积、光密度比值三项指标均明显低于溶媒组(P<0.05);用药第64天(停药2周),各组间上述三项指标均无统计学差异。拉米夫定组各时间点上述指标与溶媒组之间均无明显差异(P>0.05)。但Bay41-4109对肝组织及血清HBV DNA未见明显作用。该药未对HBV转基因小鼠血清转氨酶及体重产生明显影响。结论 Bay41-4109可有效抑制HBV转基因小鼠肝组织HBcAg表达,且效果优于拉米夫定。Bay41-4109是一种安全性较好的抗乙肝新药,其作用机制不同于拉米夫定。 展开更多
关键词 抗病毒药 小鼠 转基因 肝炎病毒 乙型
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微环DNA载体介导的shRNA在HBV转基因小鼠中的抗病毒作用 被引量：1
2
作者 李秀梅 刘光泽 +1 位作者 谢勇 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期979-984,共6页
目的探讨微环DNA载体介导的shRNA对HBV转基因小鼠体内乙肝病毒复制及表达的抑制效应。方法采用分子克隆技术制备靶向HBV基因的shRNA通用质粒p U6-shRNA HBV和微环shRNA质粒p MC-U6-shRNA HBV。将HBV转基因小鼠随机分为微环shRNA组、通... 目的探讨微环DNA载体介导的shRNA对HBV转基因小鼠体内乙肝病毒复制及表达的抑制效应。方法采用分子克隆技术制备靶向HBV基因的shRNA通用质粒p U6-shRNA HBV和微环shRNA质粒p MC-U6-shRNA HBV。将HBV转基因小鼠随机分为微环shRNA组、通用质粒shRNA组和无关质粒对照组,利用水动力转染技术分别导入p MCU6-shRNA HBV、p U6-shRNA HBV及对照载体p U6-control。于转染后第1、7、14、21、28、35天,分别采用Real-time PCR及化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)检测转基因小鼠血清HBV DNA及HBs Ag水平,免疫组化染色观察转基因小鼠肝脏HBc Ag的表达。结果质粒注射后第7~21天,p U6-shRNA HBV及p MC-U6-shRNA HBV对转基因小鼠血清HBs Ag的表达及HBV DNA的复制均有明显抑制作用,与p U6-control相比差异有统计学意义(P<0.05);21d后p U6-shRNA HBV组血清HBs Ag及HBV DNA均有所回升,至第35天基本回复至对照水平;至注射后35d,p MC-U6-shRNA HBV依然保持较强的体内抑制作用,与其他两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果显示,与p U6-shRNA HBV组相比,p MC-U6-shRNA HBV组小鼠肝组织内HBc Ag阳性细胞数明显减少。结论与p U6-shRNA HBV质粒相比,微环shRNA质粒p MC-U6-shRNA HBV对HBV转基因小鼠体内乙肝病毒的抑制作用持续时间更长久。采用微环DNA作为shRNA的体内递送载体与普通的质粒载体相比具有一定优势。 展开更多
关键词 微环载体 SHRNA 转基因小鼠 乙型肝炎
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复制型HBV转基因小鼠的建立与应用 被引量：9
3
作者 孔祥平 刘光泽 易学瑞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期954-958,共5页
尽管有了有效的疫苗,但乙肝病毒(HBV)感染依然是全球性公共卫生问题,在我国形势尤为严峻。由于HBV的自然宿主仅限于人和黑猩猩,现有的模型都有不同的缺陷,因此关于其生物学及治疗方法研究的诸多问题依然没有解决。复制型HBV转基因小鼠... 尽管有了有效的疫苗,但乙肝病毒(HBV)感染依然是全球性公共卫生问题,在我国形势尤为严峻。由于HBV的自然宿主仅限于人和黑猩猩,现有的模型都有不同的缺陷,因此关于其生物学及治疗方法研究的诸多问题依然没有解决。复制型HBV转基因小鼠模型的建立,极大地提高了我们对HBV生活史、免疫生物学和肝脏病变的免疫发病机制的认识。本文简要介绍国际上由Francis V.Chisari实验室和国内由本实验室建立的复制型HBV转基因小鼠,以及利用该模型开展抗病毒药物和乙肝发病机制的研究工作。 展开更多
关键词 小鼠 转基因 肝炎病毒 乙型 抗病毒药 模型 动物
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HBV转基因小鼠血液生理生化指标检测分析 被引量：5
4
作者 郑凤娇 傅泳航 +4 位作者 刘光泽 张建 李秀梅 陈媚娟 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期970-972,共3页
目的研究HBV基因整合对转基因小鼠代谢和血液指标的影响。方法以28只同一窝乙肝表面抗原（HBsAg）阴性小鼠和50只HBsAg阳性的HBV转基因小鼠为研究对象,鼠龄6~8周,眼眶静脉丛采血,检测血液常规指标白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋... 目的研究HBV基因整合对转基因小鼠代谢和血液指标的影响。方法以28只同一窝乙肝表面抗原（HBsAg）阴性小鼠和50只HBsAg阳性的HBV转基因小鼠为研究对象,鼠龄6~8周,眼眶静脉丛采血,检测血液常规指标白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（PLT）及淋巴细胞百分比（L%）、中间细胞百分比（M%）、分叶细胞百分比（G%）,血液生化指标葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、总蛋白（ALB）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）等,并对有差异的指标进行品种（HBsAg阳性鼠和阴性鼠）内及性别间比较分析。结果转基因小鼠血糖、尿素氮、肌酐、红细胞、血红蛋白、血小板指标与正常小鼠之间有显著差异（P〈0.05）,而其余指标无明显差异（P〉0.05）。上述6项指标在不同性别正常小鼠之间没有差异,而在不同性别转基因小鼠之间仅血糖存在差异,雄鼠血糖高于雌鼠（P〈0.05）。转基因雄鼠血糖、肌酐、尿素氮明显高于正常雄鼠,而转基因雌鼠红细胞、血红蛋白、血小板指标明显高于正常雌鼠（P〈0.05）。结论 HBVDNA对小鼠的生理生化指标有一定影响。 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 小鼠 转基因 血液化学分析
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1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备及检测 被引量：4
5
作者 陈媚娟 尤玉琴 +4 位作者 刘光泽 佟明华 黎经纬 李秀梅 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期967-969,共3页
目的制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型。方法采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠;采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况... 目的制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型。方法采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠;采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况。结果共注射受精卵2282枚,成活2024枚,注射成活率88.7%。共移植假孕雌鼠72只,59只怀孕,假孕雌鼠妊娠率81.9%。共产下F0代小鼠185只,PCR检测共有19只整合阳性,阳性率10.3%。血清荧光定量PCR结果显示,其中6只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;经传代产下F1代小鼠96只,PCR检测HBV DNA阳性33只,阳性率34.4%。血清荧光定量PCR结果显示,其中10只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;F0代和F1代小鼠随机分别各取3只进行肝脏和肾脏HBsAg免疫组化检测结果均为阳性,且肾脏表达高于肝脏。结论 1.3拷贝C基因可以在上述制备成功的C型HBV转基因小鼠体内复制和表达,并且可以遗传给下一代。 展开更多
关键词 小鼠 转基因 肝炎病毒 乙型 肝炎表面抗原 乙型
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慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定 被引量：3
6
作者 李秀梅 尤玉琴 +5 位作者 刘光泽 黎经纬 陈媚娟 陈文吟 周军辉 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期964-966,共3页
目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的... 目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度。采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠。出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况。结果病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光。包装出的慢病毒滴度为106U/ml,经浓缩后可达108U/ml。PCR检测显示,F0代小鼠GFP PCR阳性率为70.27%(26/37)。荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当。F0代、F1代中GFP均呈广泛表达。结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台。 展开更多
关键词 慢病毒属 绿色荧光蛋白质类 小鼠 转基因 转染
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YMDD突变株HBV转基因小鼠的制备及检测 被引量：3
7
作者 尤玉琴 陈阳述 +5 位作者 刘光泽 杨富强 陈媚娟 李秀梅 周军辉 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期962-963,966,共3页
目的建立YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供转基因动物模型。方法采用受精卵显微注射法,将带有YMDD突变的对拉米夫定有耐药性的1.3拷贝HBV基因注入FVB/N单细胞受精卵的原核内,制备YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠。采用PCR... 目的建立YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供转基因动物模型。方法采用受精卵显微注射法,将带有YMDD突变的对拉米夫定有耐药性的1.3拷贝HBV基因注入FVB/N单细胞受精卵的原核内,制备YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠。采用PCR检测外源基因的整合和传代情况,采用ELISA和免疫组化等方法检测HBsAg在肝、肾中的复制和表达情况。结果注射受精卵3401枚,产269只F0代仔鼠,PCR阳性33只,外源基因的整合率12.3%。9只转基因鼠血清HBVDNA弱阳性,拷贝数低于103拷贝/ml;免疫组化结果显示肝组织和肾组织均有HBsAg表达,且肾组织中的表达强于肝组织。经传代产下47只F1代转基因鼠,目的基因PCR阳性率为27.6%,且肝组织和肾组织中HBsAg均有表达,分布特性与F0代一致。结论成功制备出体内有复制表达而且可以传代YMDD耐药突变株HBV的转基因小鼠。 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 小鼠 转基因 显微注射
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HBV(ayw)转基因小鼠HBV复制中间体的检测 被引量：1
8
作者 陈阳述 尤玉琴 +5 位作者 苏蔚 易学瑞 袁有成 陈文吟 张锋 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期959-961,共3页
目的建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平。方法采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性;提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、... 目的建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平。方法采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性;提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、脾和肌肉组织总DNA,经HindⅢ酶切后电泳、转膜,利用高灵敏度化学发光杂交Southern blotting检测各组织中HBV复制中间体的水平。结果地高辛标记的化学发光检测系统灵敏度达0.1pg,且杂交系统稳定可靠。HBV(ayw)转基因小鼠基因组DNA中检测到整合的外源HBV DNA,但低于HepG2.2.15细胞的HBV复制水平。肝、肾、脾和肌肉组织中都有HBV复制中间体存在,以肝组织中含量最高。结论第27代HBV(ayw)转基因小鼠染色体含有稳定的HBV基因整合,为复制型HBV转基因小鼠。 展开更多
关键词 小鼠 转基因 肝炎病毒 乙型 双杂交系统技术
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Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定 被引量：1
9
作者 李秀梅 刘光泽 +2 位作者 陈媚娟 谢勇 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期372-375,共4页
目的制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBs Ag转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型。方法采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBs Ag基因并带有Lox P位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶... 目的制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBs Ag转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型。方法采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBs Ag基因并带有Lox P位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBs Ag转基因小鼠。将F1代OVA-HBs Ag阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBs Ag转基因小鼠HBs Ag的诱导表达情况。采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBs Ag基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况。结果共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6%。产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8%。目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5%、32.0%、22.9%、25.0%,ELISA法未检测到血清中HBs Ag表达。将F1代OVA-HBs Ag阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBs Ag基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBs Ag检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3%。结论成功制备出OVA-HBs A转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBs Ag的表达。 展开更多
关键词 小鼠 转基因 重组酶类 肝炎 乙型 慢性
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