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机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白5AC表达的影响及其信号通路机制研究 被引量：8
1
作者 钟甜 尤列.皮尔曼 +1 位作者 维克多.科罗索夫 周向东 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期397-400,共4页
目的观察机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白(MUC)表达的影响,并对其信号转导机制进行初步探讨。方法采用多功能小型生物撞击机构建体外培养的人气道黏膜上皮细胞牵张模型,分别给予丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的三条主要通路抑制... 目的观察机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白(MUC)表达的影响,并对其信号转导机制进行初步探讨。方法采用多功能小型生物撞击机构建体外培养的人气道黏膜上皮细胞牵张模型,分别给予丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的三条主要通路抑制剂:JNK抑制剂(SP600125)、p38蛋白激酶抑制剂(SB203580)及ERK1/2抑制剂(U0126)(浓度均为30μmol/L),并设未进行机械牵张的对照组和单纯机械牵张组。采用流式细胞仪检测牵张前后胞内游离Ca2+荧光强度的变化,激光共聚焦显微镜观察胞内游离Ca2+的分布情况,并分别采用RT-PCR和ELISA方法检测MUC5AC mRNA表达和蛋白分泌量。结果牵张能显著升高人气道黏膜上皮细胞胞内Ca2+浓度、MUC5AC mRNA和蛋白表达(均P<0.01)。U0126和SB203580能抑制牵张所致MUC5AC mRNA和蛋白表达增加(均P<0.01)。结论机械牵张能升高人气道黏膜上皮细胞黏蛋白表达,其机制可能与胞内Ca2+浓度的升高以及ERK1/2、p38 MAPK信号通路有关。 展开更多
关键词 机械牵张 游离钙离子 丝裂素活化蛋白激酶 黏蛋白5AC
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MARCKS磷酸化对冷刺激诱导人气道上皮细胞MUC5AC分泌的影响 被引量：6
2
作者 李敏超 尤列.皮尔曼 周向东 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期447-452,共6页
目的:构建豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物(MARCKS)磷酸化位点(PSD)突变体,并探讨瞬时受体电位M8离子通道(TRPM8)及MARCKS在冷刺激诱导黏蛋白(MUC)5AC合成及胞吐过程中发挥的作用。方法:利用PCR克隆全编码MARCKS目的基因,并通过定点突变技术... 目的:构建豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物(MARCKS)磷酸化位点(PSD)突变体,并探讨瞬时受体电位M8离子通道(TRPM8)及MARCKS在冷刺激诱导黏蛋白(MUC)5AC合成及胞吐过程中发挥的作用。方法:利用PCR克隆全编码MARCKS目的基因,并通过定点突变技术将PSD的4个丝氨酸突变为天冬氨酸编码基因。将野生型及突变体cDNA亚克隆至pcDNA3.0载体后用酶切及DNA测序鉴定。以TRPM8特异性阻断剂BCTC、重组突变质粒转染人气道上皮16HBE细胞为干预手段,用免疫荧光及ELISA检测二者对冷空气刺激诱导的16HBE细胞合成及分泌MUC5AC的影响。结果:成功构建了pcDNA3.0-MARCKS重组质粒及pcDNA3.0-MARCKS-PSD突变体。冷刺激组胞内合成及分泌MUC5AC水平显著高于未刺激对照组(P<0.05)。与冷刺激组比较,BCTC可显著抑制由冷刺激诱导的MUC5AC合成及分泌(P<0.05);与冷刺激组比较,转染MARCKS-PSD突变cDNA可显著下调由冷刺激诱导的MUC5AC高分泌水平(P<0.05),同时胞内的MUC5AC水平与对照组比较呈现显著升高状态(P<0.01),而转染载体及野生型MARCKS对冷刺激诱导的MUC5AC胞内合成及胞外分泌水平无显著影响(P>0.05)。结论:TRPM8及MARCKS-PSD的磷酸化过程介导了冷刺激诱导气道上皮细胞内MUC5AC的胞吐过程。 展开更多
关键词 豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物 瞬时受体电位melastatin离子通道 黏蛋白类
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内质网应激通路需肌醇酶1α/X盒结合蛋白1在中性粒细胞弹力蛋白酶诱导的气道黏液分泌中的作用 被引量：3
3
作者 李琪 周向东 +2 位作者 曾曼 Victor P.KOLOSOV Juliy M.PERELMAN 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期21-27,共7页
目的·探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应在中性粒细胞弹力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)诱导人气道上皮细胞黏蛋白5AC(mucin 5AC,MUC5AC)分泌中的作用及机制。方法·培养人气道上皮细胞HBE16,分别给予... 目的·探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应在中性粒细胞弹力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)诱导人气道上皮细胞黏蛋白5AC(mucin 5AC,MUC5AC)分泌中的作用及机制。方法·培养人气道上皮细胞HBE16,分别给予活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)预处理,或分别转染需肌醇酶1α(inositol-requiring kinase 1α,IRE-1α)小干扰RNA(siRNA)、X盒结合蛋白1(X-boxbinding protein 1,XBP-1)siRNA,再予以NE刺激;同时设单纯NE组和空白对照组。试剂盒检测ROS的生成水平;Westernblotting检测干预后ERS相关信号分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,pPERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、磷酸化IRE-1α(pIRE-1α)及XBP-1蛋白表达量的变化;实时荧光定量PCR检测剪切的XBP-1(XBP-1s)mRNA水平;ELISA和免疫荧光检测MUC5AC在各组细胞中的蛋白表达情况。结果·与空白对照组相比,NE刺激24 h后细胞ROS含量增加,GRP78、ATF6、pPERK及pIRE-1α蛋白水平均显著升高(均P<0.05),XBP-1s mRNA及蛋白表达也明显增加(均P<0.05),同时MUC5AC蛋白表达增加(均P<0.05);NAC及4-PBA预处理后均使上述ERS相关蛋白表达较单纯NE组降低(均P<0.05),MUC5AC蛋白水平降低(均P<0.05);转染IRE-1αsiRNA或XBP-1 siRNA,细胞中MUC5AC蛋白表达也较单纯NE组明显降低,同时XBP-1s mRNA及蛋白表达也有明显下降(均P<0.05)。结论·NE通过产生ROS引起ERS反应,诱导MUC5AC蛋白表达及分泌增加,ERS通路IRE-1α/XBP-1在其中发挥着一定的作用。 展开更多
关键词 内质网应激 需肌醇酶1α X盒结合蛋白1 中性粒细胞弹力蛋白酶 活性氧 黏蛋白5AC
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白细胞介素-13刺激大鼠气道黏液高分泌的分子机制 被引量：2
4
作者 江德鹏 Victor P Kolosov +1 位作者 Juliy M Perelman 周向东 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期73-76,共4页
目的研究白细胞介素-13(IL-13)在体内对支气管/肺黏液分泌的作用并探讨其作用机制。方法所有SD大鼠被随机分为IL-13组、对照组和IL-13 plus SP600125组。Western检测大鼠支气管/肺组织黏蛋白(MUC)5AC,磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK... 目的研究白细胞介素-13(IL-13)在体内对支气管/肺黏液分泌的作用并探讨其作用机制。方法所有SD大鼠被随机分为IL-13组、对照组和IL-13 plus SP600125组。Western检测大鼠支气管/肺组织黏蛋白(MUC)5AC,磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)和磷酸化c-Jun氨基端激酶1/2(p-JNK1/2)的表达变化,RT-PCR检测大鼠支气管/肺组织STAT4和STAT6 mRNA表达水平。EMSA检测通路下游作用因子FOXA2和激活蛋白1的表达。结果同对照组相比,IL-13刺激10 h后大鼠支气管/肺组织MUC5AC和p-JNK1/2表达升高,而p-ERK1/2表达无显著变化;使用SP600125阻断JNK通路表达后,MUC5AC表达减弱;IL-13刺激10 h后大鼠支气管/肺组织STAT4 mRNA表达无显著变化,STAT6 mRNA表达显著升高,EMSA提示IL-13刺激后大鼠支气管/肺组织FOXA2结合活性显著降低,而激活蛋白1结合活性没有明显变化。结论 IL-13能够刺激大鼠支气管/肺组织黏液分泌,其作用机制可能是通过调控STAT6-FOXA2信号通路。 展开更多
关键词 白细胞介素-13 STAT6 FOXA2蛋白 黏液
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Elafin真核表达载体的构建及其对气道粘液高分泌的调节
5
作者 余红梅 李琪 +2 位作者 尤列.皮尔曼 维克多.科罗索夫 周向东 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期440-445,共6页
目的:构建天然内生多肽Elafin真核表达载体,探讨其对气道粘液高分泌的影响。方法:抽提Elafin行RT-PCR获取Elafin cDNA,双酶切后将片段装载到pMD18-T载体上。以pMD18-T-Elafin为模板行PCR反应,产物胶回收并双酶切后定向克隆至pEGFP-N1上... 目的:构建天然内生多肽Elafin真核表达载体,探讨其对气道粘液高分泌的影响。方法:抽提Elafin行RT-PCR获取Elafin cDNA,双酶切后将片段装载到pMD18-T载体上。以pMD18-T-Elafin为模板行PCR反应,产物胶回收并双酶切后定向克隆至pEGFP-N1上,转化,筛选,双酶切鉴定重组质粒。将pEGFP-N1-Elafin转染正常人支气管上皮细胞HBE16,给予脂多糖(LPS)刺激,Western blot检测细胞内Elafin蛋白的相对含量,RT-PCR检测各组Elafin mRNA和粘蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平,荧光素酶报告基因检测系统测定核转录因子-κB(NFκ-B)的活性;ELISA法分析各组细胞MUC5AC蛋白的相对含量。结果:成功构建Elafin真核表达载体,转染重组Elafin的HBE16细胞成功表达Elafin蛋白。LPS刺激可增强NF-κB的活性,该活性在转染重组Elafin后显著降低;MUC5AC蛋白含量及mRNA水平在LPS刺激后也显著升高,在转染重组Elafin后二者的表达水平明显降低。结论:Elafin真核表达载体成功构建,初步发现Elafin可通过降低NFκ-B的活性来下调MUC5AC的表达,为进一步深入研究其对气道粘液高分泌的调节机制奠定了基础。 展开更多
关键词 ELAFIN 粘蛋白 脂多糖 核转录因子-ΚB
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Cortactin在应力诱导的气道黏液分泌过程中的介导作用 被引量：2
6
作者 吴海丰 李琪 +3 位作者 Juliy M Perelman Victor P Kolosov Andrei Shpakou 周向东 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1354-1357,共4页
目的:探讨皮层肌动蛋白结合肽(Cortactin)对剪应力(SS)诱导的气道黏液高分泌的影响及其关键靶点。方法:体外培养气道上皮细胞Beas-2B,并随机分为6组:空白对照组、SS组、SS+Wild-Cortactin组、SS+pcDNA3-Cortactin 421 -MU组、SS+pcDNA3-... 目的:探讨皮层肌动蛋白结合肽(Cortactin)对剪应力(SS)诱导的气道黏液高分泌的影响及其关键靶点。方法:体外培养气道上皮细胞Beas-2B,并随机分为6组:空白对照组、SS组、SS+Wild-Cortactin组、SS+pcDNA3-Cortactin 421 -MU组、SS+pcDNA3-Cortactin 466 -MU组、SS+pcDNA3-Cortactin 482 -MU组。用Western blot法检测Cortactin蛋白、p-Cortactin蛋白表达水平,RT-PCR、ELISA法分别检测MUC5AC 转录水平和MUC5AC的分泌量。结果:转染Cortactin各型重组表达载体后细胞Cortactin蛋白明显增加,提示转染成功。转染Wild-Cortactin后再予剪应力处理,细胞的p-Cortactin蛋白、MUC5AC mRNA及蛋白表达显著增加。而转染pcDNA3-Cortactin 466 -MU后,细胞p-Cortactin蛋白、细胞培养上清液MUC5AC的相对分泌量显著下降,但MUC5AC的转录水平无明显影响。结论:在剪应力刺激诱导的气道上皮细胞MUC5AC高分泌过程中,Cortactin具有重要的介导作用,且Y466为其介导该过程的潜在关键作用靶点。 展开更多
关键词 皮层肌动蛋白结合肽 黏蛋白5AC 气道剪应力
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节律性压力波对家犬气道黏蛋白分泌平衡的影响及其机制
7
作者 刘诗兰 尤列.皮尔曼 +1 位作者 维克多.科罗索夫 周向东 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期670-675,共6页
目的:观察不同压力对家犬气道黏液层黏蛋白(MUC)分泌的影响,并初步探讨其参与机制。方法:24只健康家犬行双腔支气管导管插管,并随机分为4组(n=6)。A组家犬正常呼吸的频率及压力双侧通气(A1,A2);B组一侧不通气(B1),另一侧予以过量通气(B2... 目的:观察不同压力对家犬气道黏液层黏蛋白(MUC)分泌的影响,并初步探讨其参与机制。方法:24只健康家犬行双腔支气管导管插管,并随机分为4组(n=6)。A组家犬正常呼吸的频率及压力双侧通气(A1,A2);B组一侧不通气(B1),另一侧予以过量通气(B2);C组预先张力敏感性阳离子通道4(TRPV4)阻断剂钉红(RR)后按A组通气模式通气(C1,C2);D组预先TRPV4阻断剂RR处理后按B组通气模式通气(D1,D2)。通气12 h后,ELISA检测3组支气管灌洗液(BALF)中MUC(2,5AC和5B)蛋白含量;RT-PCR检测支气管肺组织匀浆中MUC(2,5AC和5B)mRNA转录水平。结果:与正常通气的A2组比较,过量通气的B2组家犬BALF中3种MUC蛋白含量显著升高,且以MUC5AC为主(P<0.05);与A1组比较,未通气的B1组则明显下降(P<0.05)。与A1,A2组比较,给予RR处理后的C1,C2组蛋白含量均明显降低(P<0.05)。与过量通气的B2组比较,给予TRPV4特异性阻断剂处理后再过量通气的D2组3种MUC蛋白含量亦明显下降(P<0.05)。与A2组比较过量通气的B2组肺组织MUC(2,5AC和5B)mRNA表达均明显上调(P<0.05);与A1,A2比较,给予RR处理后C1,C2组肺组织3种MUC mRNA转录水平显著下降(P<0.05);给予RR预处理后与B2组相比,D2组内MUC mRNA转录水平显著下调(P<0.05)。结论:节律性压力波参与维持家犬气道上皮黏液层黏蛋白分泌平衡调控,其机制主要通过TRPV4通道实现。 展开更多
关键词 节律性压力波 张力敏感性阳离子通道 黏蛋白
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