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基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对Ⅰ型干扰素转录的影响
被引量：
4
1
作者
黄秋艳
杨烨城
+5 位作者
张昆丽
孟繁明
李剑豪
朱向星
王塑天
唐冬生
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第4期891-898,共8页
【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设...
【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。
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关键词
CRISPR/Cas9
STING基因
猪肺泡巨噬细胞
基因敲除
Ⅰ型干扰素
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职称材料
藏猪和杜藏猪生长、肉质性状及脂肪沉积相关基因的表达差异分析
被引量：
10
2
作者
杨烨城
黄秋艳
+7 位作者
辛海云
李宝红
杜宗亮
孟繁明
朱向星
李剑豪
王塑天
唐冬生
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第4期926-934,共9页
【目的】明确藏猪和杜藏猪(杜洛克父本与藏猪母本杂交F;代)的生长和胴体性状及肉质指标等表型差异,并分析背最长肌中脂肪沉积相关基因的表达差异,为藏猪种质资源利用及猪脂肪沉积规律研究提供参考依据。【方法】以藏猪和杜藏猪为研究对...
【目的】明确藏猪和杜藏猪(杜洛克父本与藏猪母本杂交F;代)的生长和胴体性状及肉质指标等表型差异,并分析背最长肌中脂肪沉积相关基因的表达差异,为藏猪种质资源利用及猪脂肪沉积规律研究提供参考依据。【方法】以藏猪和杜藏猪为研究对象,分别测定其体长、体高和胸围等生长性状,屠宰率、背膘厚及眼肌面积等胴体性状,以及pH、肉色、蒸煮损失及肌内脂肪含量等肉质指标;并通过荧光实时定量PCR检测脂肪沉积相关基因在2种猪背最长肌中的表达情况。【结果】杜藏猪的左胴体重、右胴体重、屠宰前重、胴体长、体长、体高、管围和胸围均高于藏猪,且差异显著(P<0.05,下同),眼肌面积(33.00±3.84 cm;)也显著大于藏猪(16.83±1.81 cm;),背膘厚(13.15±2.48 mm)则显著低于藏猪(22.83±2.80 mm),藏猪与杜藏猪的皮厚、腹围和屠宰率无显著差异(P>0.05,下同);杜藏猪肌肉的pH-24 h、熟肉率、剪切力和含水率显著高于藏猪肌肉,而杜藏猪肉色的a-24 h值(10.30±1.06)和肌内脂肪含量[(2.48±1.44)%]显著低于藏猪。除GHR基因外,其他脂肪沉积相关基因的相对表达量均表现为杜藏猪低于藏猪,其中,ADIPOQ基因和FASN基因的相对表达量显著低于藏猪,IGF1基因、TNFa基因和Leptin基因的相对表达量极显著低于藏猪(P<0.01)。相关分析结果显示,GHR基因相对表达量与杜藏猪肌内脂肪含量呈显著正相关,FASN基因相对表达量与藏猪肌内脂肪含量呈显著正相关,IGF1基因相对表达量与藏猪背膘呈显著负相关。【结论】杜藏猪的肉质性状与藏猪相似,但杜藏猪具有更佳的生长性能,说明以杜洛克为父本与藏猪母本杂交得到的杜藏猪具有更优的生产效率。藏猪和杜藏猪的肌内脂肪含量差异与脂肪沉积相关基因的表达差异有关,即猪的肌内脂肪含量受多种脂肪沉积相关基因调控。
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关键词
藏猪
杜藏猪
生长性状
肉质性状
脂肪沉积相关基因
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职称材料
题名
基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对Ⅰ型干扰素转录的影响
被引量：
4
1
作者
黄秋艳
杨烨城
张昆丽
孟繁明
李剑豪
朱向星
王塑天
唐冬生
机构
佛山科学技术学院生命科学与工程学院/广东省动物分子设计与精准育种重点实验室/广东省基因编辑工程技术研究中心
广东省
农业
科学
院
动物
科学
研究
所/畜禽
育种
国家
重点
实验室
/广东省
畜禽
育种
与营养
研究
重点
实验室
广东省
农业
科学
院
动物
卫生
研究
所
/广东省
畜禽疫病防治
研究
重点
实验室
/农业农村部兽用药物与诊断
技术
广东
科学
观测
实验
站
出处
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第4期891-898,共8页
基金
国家自然科学基金项目(32002153,32002298)
广州市基础与应用基础研究项目(202102020177)
广东省农业科学院科技创新战略专项(R2019YJ-YB2004)。
文摘
【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。
关键词
CRISPR/Cas9
STING基因
猪肺泡巨噬细胞
基因敲除
Ⅰ型干扰素
Keywords
CRISPR/Cas9
STING gene
pig alveolar macrophage cell 1cells
gene knockout
typeⅠinterferon transeniplion
分类号
S852.43 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
藏猪和杜藏猪生长、肉质性状及脂肪沉积相关基因的表达差异分析
被引量：
10
2
作者
杨烨城
黄秋艳
辛海云
李宝红
杜宗亮
孟繁明
朱向星
李剑豪
王塑天
唐冬生
机构
佛山科学技术学院生命科学与工程学院/广东省动物分子设计与精准育种重点实验室/广东省基因编辑工程技术研究中心
广东省
农业
科学
院
动物
科学
研究
所/畜禽
育种
国家
重点
实验室
/广东省
畜禽
育种
与营养
研究
重点
实验室
出处
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第4期926-934,共9页
基金
广东省基础与应用基础研究基金温氏联合基金项目(2019B1515210013)
广东省普通高校重点领域专项(2021ZDZX2050)
广东省农业科学院科技创新战略专项(R2019YJ-YB2004)。
文摘
【目的】明确藏猪和杜藏猪(杜洛克父本与藏猪母本杂交F;代)的生长和胴体性状及肉质指标等表型差异,并分析背最长肌中脂肪沉积相关基因的表达差异,为藏猪种质资源利用及猪脂肪沉积规律研究提供参考依据。【方法】以藏猪和杜藏猪为研究对象,分别测定其体长、体高和胸围等生长性状,屠宰率、背膘厚及眼肌面积等胴体性状,以及pH、肉色、蒸煮损失及肌内脂肪含量等肉质指标;并通过荧光实时定量PCR检测脂肪沉积相关基因在2种猪背最长肌中的表达情况。【结果】杜藏猪的左胴体重、右胴体重、屠宰前重、胴体长、体长、体高、管围和胸围均高于藏猪,且差异显著(P<0.05,下同),眼肌面积(33.00±3.84 cm;)也显著大于藏猪(16.83±1.81 cm;),背膘厚(13.15±2.48 mm)则显著低于藏猪(22.83±2.80 mm),藏猪与杜藏猪的皮厚、腹围和屠宰率无显著差异(P>0.05,下同);杜藏猪肌肉的pH-24 h、熟肉率、剪切力和含水率显著高于藏猪肌肉,而杜藏猪肉色的a-24 h值(10.30±1.06)和肌内脂肪含量[(2.48±1.44)%]显著低于藏猪。除GHR基因外,其他脂肪沉积相关基因的相对表达量均表现为杜藏猪低于藏猪,其中,ADIPOQ基因和FASN基因的相对表达量显著低于藏猪,IGF1基因、TNFa基因和Leptin基因的相对表达量极显著低于藏猪(P<0.01)。相关分析结果显示,GHR基因相对表达量与杜藏猪肌内脂肪含量呈显著正相关,FASN基因相对表达量与藏猪肌内脂肪含量呈显著正相关,IGF1基因相对表达量与藏猪背膘呈显著负相关。【结论】杜藏猪的肉质性状与藏猪相似,但杜藏猪具有更佳的生长性能,说明以杜洛克为父本与藏猪母本杂交得到的杜藏猪具有更优的生产效率。藏猪和杜藏猪的肌内脂肪含量差异与脂肪沉积相关基因的表达差异有关,即猪的肌内脂肪含量受多种脂肪沉积相关基因调控。
关键词
藏猪
杜藏猪
生长性状
肉质性状
脂肪沉积相关基因
Keywords
Tibetan pig
Duzang pig
growth traits
meat quality traits
fat deposition-related genes
分类号
S828.89 [农业科学—畜牧学]
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题名
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被引量
操作
1
基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对Ⅰ型干扰素转录的影响
黄秋艳
杨烨城
张昆丽
孟繁明
李剑豪
朱向星
王塑天
唐冬生
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022
4
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职称材料
2
藏猪和杜藏猪生长、肉质性状及脂肪沉积相关基因的表达差异分析
杨烨城
黄秋艳
辛海云
李宝红
杜宗亮
孟繁明
朱向星
李剑豪
王塑天
唐冬生
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022
10
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