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基于非洲猪瘟病毒I177L和p72基因的双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立
被引量：
8
1
作者
曾繁聪
姜含雨
+7 位作者
辛宁
柯骏鸿
罗瑞
何淑仪
张桂红
马春全
黄淑坚
陈耀
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第9期952-957,共6页
为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法,本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列,设计特异性引物及探针,经反应条件优化后建立一种双重Taq Man荧光定量PCR方法。绘制的标准曲...
为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法,本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列,设计特异性引物及探针,经反应条件优化后建立一种双重Taq Man荧光定量PCR方法。绘制的标准曲线结果显示,两个重组质粒标准品p18T-I177L和p18T-p72相关系数R^(2)均在0.99以上,扩增效率E为88%~90%。表明两个重组质粒标准品的拷贝数均与各自的Ct值有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅特异性扩增ASFV I177L和p72基因,对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对p18T-I177L和p18T-p72质粒标准品的检测下限分别为4.63×10^(2)拷贝/μL和4.09×10^(2)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.4%,重复效果好。分别利用该方法与ASFV荧光定量PCR检测试剂盒检测57份猪鼻拭子核酸样品,结果显示该方法检测出47份阳性核酸,10份阴性核酸样品。ASFV荧光定量试剂盒检测出46份阳性核酸,11份阴性核酸样品。二者的总符合率达94.7%,且二者的Kappa=0.825>0.75,P=1>0.05,表明两种方法无统计学差异且一致性良好。本研究建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于ASFV的检测、鉴别检测和流行病学的调查研究。
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关键词
非洲猪瘟病毒
双重荧光定量PCR
检测方法
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职称材料
非洲猪瘟病毒I177L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
2
作者
曾繁聪
柯骏鸿
+9 位作者
姜含雨
辛宁
罗瑞
谢梓民
杨惠湖
易和友
张桂红
何淑仪
黄淑坚
陈耀
《动物医学进展》
北大核心
2023年第3期8-14,共7页
为了制备抗非洲猪瘟病毒I177L蛋白的多克隆抗体,根据HLJ/2018株的I177L序列,设计引物,扩增带有His标签序列的I177L序列,并将其插入pMAL-c5x原核表达载体中,转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达和切胶纯化后,用Xa蛋白酶因子...
为了制备抗非洲猪瘟病毒I177L蛋白的多克隆抗体,根据HLJ/2018株的I177L序列,设计引物,扩增带有His标签序列的I177L序列,并将其插入pMAL-c5x原核表达载体中,转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达和切胶纯化后,用Xa蛋白酶因子去除重组蛋白中的MBP标签。将处理后的I177L蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37℃、0.6 mmol/L IPTG条件下,诱导5 h后,重组MBP-I177L蛋白表达量最高,蛋白分子质量大小约为67 ku,与预期大小相符;重组蛋白以可溶性表达为主;多克隆抗体经Western blot、间接ELISA及IFA试验结果显示,抗体效价为1∶128000,并且该抗体能特异性识别I177L蛋白。
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关键词
非洲猪瘟病毒
I177L蛋白
原核表达
多克隆抗体
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职称材料
题名
基于非洲猪瘟病毒I177L和p72基因的双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立
被引量：
8
1
作者
曾繁聪
姜含雨
辛宁
柯骏鸿
罗瑞
何淑仪
张桂红
马春全
黄淑坚
陈耀
机构
佛山
科学
技术
学院生命科学与工程学院
佛山国康检测技术有限公司
华南农业大学兽医学院
国
家非洲猪瘟区域实验室(广州)
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第9期952-957,共6页
基金
广东省重点领域研发计划资助项目(2019B020211003)
佛山科学技术学院横向课题(KH22001)。
文摘
为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法,本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列,设计特异性引物及探针,经反应条件优化后建立一种双重Taq Man荧光定量PCR方法。绘制的标准曲线结果显示,两个重组质粒标准品p18T-I177L和p18T-p72相关系数R^(2)均在0.99以上,扩增效率E为88%~90%。表明两个重组质粒标准品的拷贝数均与各自的Ct值有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅特异性扩增ASFV I177L和p72基因,对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对p18T-I177L和p18T-p72质粒标准品的检测下限分别为4.63×10^(2)拷贝/μL和4.09×10^(2)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.4%,重复效果好。分别利用该方法与ASFV荧光定量PCR检测试剂盒检测57份猪鼻拭子核酸样品,结果显示该方法检测出47份阳性核酸,10份阴性核酸样品。ASFV荧光定量试剂盒检测出46份阳性核酸,11份阴性核酸样品。二者的总符合率达94.7%,且二者的Kappa=0.825>0.75,P=1>0.05,表明两种方法无统计学差异且一致性良好。本研究建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于ASFV的检测、鉴别检测和流行病学的调查研究。
关键词
非洲猪瘟病毒
双重荧光定量PCR
检测方法
Keywords
African swine fever virus
duplex Taq Man real-time PCR
detection method
分类号
S852.65 [农业科学—基础兽医学]
在线阅读
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职称材料
题名
非洲猪瘟病毒I177L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
2
作者
曾繁聪
柯骏鸿
姜含雨
辛宁
罗瑞
谢梓民
杨惠湖
易和友
张桂红
何淑仪
黄淑坚
陈耀
机构
佛山
科学
技术
学院生命科学与工程学院
华南农业大学兽医学院
国
家非洲猪瘟区域实验室
佛山国康检测技术有限公司
出处
《动物医学进展》
北大核心
2023年第3期8-14,共7页
基金
广东省重点领域研发计划项目(2019B020211003)
佛山科学技术学院横向合作项目(KH22001)。
文摘
为了制备抗非洲猪瘟病毒I177L蛋白的多克隆抗体,根据HLJ/2018株的I177L序列,设计引物,扩增带有His标签序列的I177L序列,并将其插入pMAL-c5x原核表达载体中,转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达和切胶纯化后,用Xa蛋白酶因子去除重组蛋白中的MBP标签。将处理后的I177L蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37℃、0.6 mmol/L IPTG条件下,诱导5 h后,重组MBP-I177L蛋白表达量最高,蛋白分子质量大小约为67 ku,与预期大小相符;重组蛋白以可溶性表达为主;多克隆抗体经Western blot、间接ELISA及IFA试验结果显示,抗体效价为1∶128000,并且该抗体能特异性识别I177L蛋白。
关键词
非洲猪瘟病毒
I177L蛋白
原核表达
多克隆抗体
Keywords
African swine fever virus
I177L protein
prokaryotic expression
polyclonal antibody
分类号
S852.659.1 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
基于非洲猪瘟病毒I177L和p72基因的双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立
曾繁聪
姜含雨
辛宁
柯骏鸿
罗瑞
何淑仪
张桂红
马春全
黄淑坚
陈耀
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022
8
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
非洲猪瘟病毒I177L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
曾繁聪
柯骏鸿
姜含雨
辛宁
罗瑞
谢梓民
杨惠湖
易和友
张桂红
何淑仪
黄淑坚
陈耀
《动物医学进展》
北大核心
2023
0
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