靶向MyD88基因siRNA的筛选及其对狂犬病病毒感染的影响初探

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作者 蔡宗伶 栗朵朵 +2 位作者 谭深根 李晓宁 罗廷荣 《广西畜牧兽医》 2025年第1期1-4,共4页

为探究MyD88在狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染中的作用,本实验针对MyD88的mRNA靶序列设计并合成3对不同的siRNA序列,利用脂质体瞬时转染BV2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western blot检测siRNA对BV2细胞中MyD88的干扰效率。结果显示,... 为探究MyD88在狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染中的作用,本实验针对MyD88的mRNA靶序列设计并合成3对不同的siRNA序列,利用脂质体瞬时转染BV2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western blot检测siRNA对BV2细胞中MyD88的干扰效率。结果显示,转染24 h后,各实验组中MyD88 mRNA表达量均显著低于阴性对照组,其中siRNA-M174的效果最佳、siRNA-M587次之;将200 nM siRNA-M174、siRNA-M587转染BV2细胞24 h后,经计算,干扰效率分别为75.35%和71%,两者共转染后,干扰效率为86.5%。结果表明,本实验成功筛选出靶向MyD88基因的有效干扰序列。脂质体瞬时转染筛选出的2对siRNA于BV2细胞,RABV接种BV2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western blot检测。接毒后转染24 h,实验组MyD88基因的mRNA表达量低于阴性对照组,MyD88蛋白及RABV的N蛋白表达量下降。本实验结果证实了MyD88基因被特异性siRNA干扰后,也影响RABV的蛋白合成,为后续MyD88与狂犬病病毒的互作研究提供实验依据。 展开更多

关键词 MYD88 SIRNA RNAI 狂犬病病毒

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狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析 被引量：1

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作者 张银 金硕 +7 位作者 栗朵朵 Abraha Bahlbi Kiflu 韩菲 武梦思 凌小清 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期2634-2642,共9页

【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对... 【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对象,利用反向遗传技术将其P基因分别替换到弱毒株rRC-HL和r RC-HL(GX01M)株的对应位置,通过间接免疫荧光试验(IFA)及基因测序鉴定拯救的病毒,并测定重组突变体的多步生长曲线、荧光灶面积及N基因表达水平等,同时通过4周龄昆明小鼠攻毒试验验证P基因及P-M基因联合替换后对RABV致病性的影响。【结果】利用反向遗传技术能成功拯救重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M),通过IFA测定病毒荧光灶面积及多步生长曲线发现,r RC-HL(GX01P-M)株在BSR/T7-9细胞上的生长能力及传播能力均较rRC-HL(GX01P)株和rRC-HL(GX01M)株强。在复制与转录水平上,rRC-HL(GX01P)株的N基因相对表达量高于r RC-HL(GX01M)株,但低于rRC-HL(GX01P-M)株。在昆明小鼠攻毒试验中,重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M)攻毒后第4 d昆明小鼠开始出现精神不振、行动迟缓等症状,其致病性无明显差异;昆明小鼠体质量均呈一过性减轻,之后恢复正常并呈上升趋势;攻毒15 d内均未见昆明小鼠死亡,即重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRCHL(GX01P-M)的致病性较弱。【结论】强毒株GX01的P基因与M基因联合替换可提高病毒传播能力,且二者具有协同性,但对弱毒株rRC-HL的毒力无影响。 展开更多

关键词 狂犬病病毒(RABV) P蛋白 M蛋白 联合替换 生物学特性

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干扰STAT1基因表达对狂犬病病毒感染的影响

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作者 栗朵朵 蔡宗伶 +2 位作者 张宏燕 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期3718-3727,共10页

【目的】探讨信号转导和转录激活因子1(STAT1)在狂犬病病毒(RABV)感染过程中的作用机制,为后续STAT1功能研究提供理论依据。【方法】以RABV感染小鼠小脑星形胶质细胞(C8-D1A),于接毒后12、24和48 h分别采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印... 【目的】探讨信号转导和转录激活因子1(STAT1)在狂犬病病毒(RABV)感染过程中的作用机制,为后续STAT1功能研究提供理论依据。【方法】以RABV感染小鼠小脑星形胶质细胞(C8-D1A),于接毒后12、24和48 h分别采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹(Western blotting)检测病毒基因及宿主细胞STAT1和细胞因子的表达变化;针对STAT1基因靶序列设计合成不同的siRNA序列,通过脂质体法瞬时转染C8-D1A细胞,筛选出干扰效率较高的STAT1-siRNA序列;然后以筛选出的STAT1-siRNA序列转染C8-D1A细胞,转染24 h后接种0.1 MOI的RABV,分别从转录水平和蛋白水平检测干扰STAT1基因表达对RABV复制及细胞因子表达的影响。【结果】RABV感染C8-D1A细胞后能引起STAT1蛋白的表达大幅度上升;无论是弱毒株rRC-HL还是标准强毒株CVS-11感染,都能引起C8-D1A细胞内IFN-α、IFN-β、TNF-α和IL-6等细胞因子基因上调表达。经STAT1-siRNA干扰效果验证,发现在最高浓度200 nmol/L下作用24 h后,STAT1-1616的干扰效率为81%、STAT1-2271的干扰效率为82%,干扰效果达极显著水平(P<0.01);作用48 h后,STAT1-1616的干扰效率为83%,STAT1-2271的干扰效率为75%,干扰效果达显著水平(P<0.05),故选择这2对STAT1-siRNA进行后续试验。干扰STAT1基因表达后,无论是接种弱毒株rRC-HL还是接种标准强毒株CVS-11,其N和P基因的表达均呈上调趋势,病毒N、P蛋白在接毒后24和36 h均呈上调表达趋势,说明干扰STAT1基因表达有利于上调病毒蛋白合成,而促进RABV复制;但干扰STAT1基因表达对RABV感染引起宿主细胞产生IFN-α、IFN-β、TNF-α和IL-6等细胞因子无显著影响(P>0.05)。【结论】合成的2对STAT1-siRNA序列(STAT1-1616和STAT1-2271)对C8-D1A细胞的STAT1基因有显著干扰效果。干扰STAT1基因表达有利于上调病毒蛋白合成,而促进RABV复制。 展开更多

关键词 狂犬病病毒(RABV) 信号转导和转录激活因子1基因(STAT1) RNA干扰 干扰效率 细胞因子

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不同氮效率木薯品种根系形态、构型及氮吸收动力学特征 被引量：22

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作者 康亮 梁琼月 +4 位作者 姚一华 蒋强 董蒙蒙 顾明华 何冰 《植物营养与肥料学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1920-1928,共9页

【目的】比较分析低氮(N)条件下不同氮效率木薯品种的根系形态、构型及吸收动力学变化,以阐明木薯氮高效吸收机制,为指导木薯生产和木薯品种选育提供理论基础。【方法】于2015年在广西大学国家重点实验室温室大棚内进行了试验。盆栽试... 【目的】比较分析低氮(N)条件下不同氮效率木薯品种的根系形态、构型及吸收动力学变化,以阐明木薯氮高效吸收机制,为指导木薯生产和木薯品种选育提供理论基础。【方法】于2015年在广西大学国家重点实验室温室大棚内进行了试验。盆栽试验采用双因素(品种×氮水平)区组设计。供试木薯品种包括氮高效品种华南10号(SC10)与氮低效品种华南205(SC205)。氮水平包括不施氮(N0)和施N 55.2 mg/kg土(N1)。每盆装10kg土,种植1株幼苗。木薯出苗60天后,取出并洗净根系,利用根系扫描仪EPSON2000进行根系图像采集,利用WinRHIZO PRO根系分析软件分析图片,获得根系形态指标。将整株植株分成根、茎、叶三个部分,测量干重和氮含量。根系分层试验在大型根系观测系统中进行。吸收动力学试验采用改进常规耗竭法,并比较分析了木薯根系形态、根系构型特征及硝态氮吸收动力学参数差异。【结果】N1和N0条件下,氮高效品种SC10生物量和氮素积累量均显著高于氮低效品种SC205(P<0.05)。N0条件下,SC10的整株生物量降幅为37.4%,SC205的降幅为69.4%,品种SC10的降幅显著低于SC205(P<0.05);SC10的根、茎、叶和全株氮积累量均显著高于SC205,全株氮积累量为SC205的152%。与N1相比,N0处理的木薯品种SC10总根长、根系表面积和细根根长的降幅分别为11.0%、10.0%和20.4%,SC205的降幅分别高达35.9%、27.7%和50.2%,两个品种下降幅度差异显著(P<0.05)。低氮诱导木薯根系分布下移,SC10根系呈上宽下窄三角形,最深可达180 cm土层;SC205根系呈椭圆形,最深达130cm土层。氮素吸收动力学试验结果发现SC10、SC205的Km分别为3.27和7.87 mmol/L,表明SC10根系对NO3–的亲和性更高。【结论】氮高效品种SC10的根系对硝态氮的亲和力(Km)几乎是氮低效品种SC205的两倍。在氮素胁迫条件下,氮高效品种可形成优于氮低效品种的根系构型,特别是根系的总根长、根系表面积和细根根长的下降幅度显著小于氮低效品种,是有效缓解氮胁迫的重要原因。 展开更多

关键词 木薯 氮素 根系形态与构型 硝态氮亲和力

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高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建 被引量：6

5

作者 卢双楠 李粲 +10 位作者 滕峥 刘开雨 刘芳 邱永福 梁朝旭 方位宽 何姗珊 刘晓静 李鸣 梁俊 李容柏 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期1262-1268,共7页

【目的】利用载体重组技术分别将高山离子芥冷诱导基因(Cbcor15a)和报告基因eGFP插入载体pCambia1300-bar,并引入玉米泛素基因启动子UBi-1代替载体本身启动子CaMV35s,重组为适合甘蔗转基因的二元植物表达载体pCambia1300-cbcor15a-bar... 【目的】利用载体重组技术分别将高山离子芥冷诱导基因(Cbcor15a)和报告基因eGFP插入载体pCambia1300-bar,并引入玉米泛素基因启动子UBi-1代替载体本身启动子CaMV35s,重组为适合甘蔗转基因的二元植物表达载体pCambia1300-cbcor15a-bar。【方法】参照pCambia1300-bar载体多克隆位点和基因Cbcor15a、eGFP和启动子UBi-1的核苷酸序列设计引物,通过载体重组技术将基因和启动子分别插入相应的位点。利用基因枪分别将pCambia1300-bar载体和重组载体导入洋葱表皮细胞,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察。【结果】与导入pCambia1300-bar载体的洋葱表皮细胞相比较,导入重组载体pCambia1300-cbcor15a-bar的洋葱表皮细胞内有强烈的绿色荧光信号。【结论】重组甘蔗转基因二元植物表达载体启动子Ubi-1能够调控下游冷诱导基因Cbcor15a和报告基因eGFP的正常高效表达,为外源基因Cbcor15a转化甘蔗提供保障。 展开更多

关键词 Cbcor15a 甘蔗 转基因 植物表达载体构建 瞬时表达

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一个水稻黄绿叶突变基因的定位和遗传研究 被引量：6

6

作者 初志战 郭海滨 +2 位作者 刘小林 陈远玲 刘耀光 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期684-689,共6页

从粳稻品种日本晴经^(60)Co-γ诱变的M1材料中发现一个黄绿叶突变体,其叶片从萌发到三叶前期表现白化,三叶后期开始转为黄绿叶,直到衰老。遗传分析表明,该突变表型受一对隐性核基因控制,将该黄绿叶突变体暂定名为ygl8951。与野生型相比,... 从粳稻品种日本晴经^(60)Co-γ诱变的M1材料中发现一个黄绿叶突变体,其叶片从萌发到三叶前期表现白化,三叶后期开始转为黄绿叶,直到衰老。遗传分析表明,该突变表型受一对隐性核基因控制,将该黄绿叶突变体暂定名为ygl8951。与野生型相比,ygl8951的叶绿素含量与类胡萝卜素含量显著降低。电子显微镜观察表明ygl8951内叶绿体数量明显减少,叶绿体内没有基粒类囊体,只有类似间质类囊体结构。基因表达定量分析表明,突变体中光系统I和光系统II基因表达水平明显下调,核糖体结构基因和质体编码的RNA聚合酶亚基基因表达明显上调。利用ygl8951与籼稻品种黄华占杂交获得的F_2分离群体,将该基因定位于水稻第6染色体上的In/Del标记607489与607611之间,物理距离191 kb的范围内,通过分析确认该基因为一个新的调控叶色的基因。 展开更多

关键词 水稻 黄绿叶 基因定位 遗传分析

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一个水稻白化致死突变基因的精细定位和遗传研究 被引量：5

7

作者 初志战 刘小林 +1 位作者 陈远玲 刘耀光 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期136-142,共7页

从粳稻品种日本晴经60 Co诱变的M1代材料中发现了一个白化致死突变体,该突变体从萌芽后一直表现白化,3叶期后逐渐衰亡。遗传分析表明,该突变表型受一对隐性核基因控制,将该白化突变体暂定名为al14。与野生型相比,al14突变体的叶绿素含... 从粳稻品种日本晴经60 Co诱变的M1代材料中发现了一个白化致死突变体,该突变体从萌芽后一直表现白化,3叶期后逐渐衰亡。遗传分析表明,该突变表型受一对隐性核基因控制,将该白化突变体暂定名为al14。与野生型相比,al14突变体的叶绿素含量与类胡萝卜素含量显著降低。电子显微镜观察表明al14突变体不能形成完整的叶绿体,只有原片层体结构。对叶绿体编码基因的表达分析发现,突变体中光系统Ⅰ和光系统Ⅱ基因表达明显下调,核糖体结构基因和质体编码的RNA聚合酶亚基基因表达明显上调,但是PsbN(photosystemⅡprotein N)却上调表达水平最高,达到118.23倍。利用al14突变体与黄华占杂交获得的F2代分离群体进行基因定位,将该基因定位于水稻第6染色体上约40kb的范围。目前,该范围内没有叶色相关基因的报道,可能为一新的调控叶绿体发育的基因。 展开更多

关键词 水稻 白化致死 基因定位

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普通野生稻苗期耐冷性QTLs的互作和聚合效应分析 被引量：4

8

作者 郑加兴 张月雄 +7 位作者 覃宝祥 邱永福 蒙姣荣 刘芳 马增凤 刘驰 李容柏 陈保善 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期29-36,共8页

【目的】普通野生稻Oryza rufipogon Griff.蕴含丰富的遗传多样性,对其进行耐冷性数量性状位点(QTLs)的挖掘和效应分析,可为水稻耐冷性分子育种提供宝贵的基因资源和理论支持.【方法】以籼稻品种9311为受体亲本、普通野生稻品系DP15和D... 【目的】普通野生稻Oryza rufipogon Griff.蕴含丰富的遗传多样性,对其进行耐冷性数量性状位点(QTLs)的挖掘和效应分析,可为水稻耐冷性分子育种提供宝贵的基因资源和理论支持.【方法】以籼稻品种9311为受体亲本、普通野生稻品系DP15和DP30为供体亲本,构建染色体片段代换系,鉴定了18个水稻苗期耐冷QTLs,将其中分别包含4个耐冷QTL且遗传背景一致的4个代换系qSCT-1-CSSL、qSCT-4-CSSL、qSCT-8-CSSL和qSCT-12-CSSL分别两两杂交得到2个聚合系(qSCT-1/qSCT-12)-CSSL和(qSCT-4/qSCT-8)-CSSL,对聚合系中各耐冷QTL的互作效应及聚合效应进行研究.【结果和结论】4个耐冷QTL对水稻耐冷性有加性效应;互作分析显示各耐冷QTL间在聚合系中均存在正向互作.聚合效应在qSCT-4与qSCT-8间表现为QTL间明显的累加效应,而qSCT-1与qSCT-12间聚合的累加效应不明显,表现为qSCT-12对qSCT-1有上位作用. 展开更多

关键词 普通野生稻 耐冷性 数量性状位点(QTLs) 染色体片段代换系 聚合效应

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籼粳稻基因组295个InDel标记的开发 被引量：8

9

作者 初志战 郭海滨 +1 位作者 曾栋昌 刘耀光 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期932-941,共10页

插入/缺失(InDel)分子标记具有使用简单,结果清晰可靠的优点。本研究通过比对粳稻品种日本晴和籼稻品种93-11的基因组序列,在全基因组范围内设计了634对InDel候选标记,通过PCR检测比较2种粳稻(日本晴和台中65)和2种籼稻(93-11和黄华占)... 插入/缺失(InDel)分子标记具有使用简单,结果清晰可靠的优点。本研究通过比对粳稻品种日本晴和籼稻品种93-11的基因组序列,在全基因组范围内设计了634对InDel候选标记,通过PCR检测比较2种粳稻(日本晴和台中65)和2种籼稻(93-11和黄华占)的多态性,发现295对标记在2种籼稻间及2种粳稻间均带型一致,而在籼、粳亚种间有多态性,因此这套295对标记可以在涉及籼粳亚种的基因定位和分子育种中应用。 展开更多

关键词 INDEL标记 水稻 基因定位

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铁蛋白Ferritin原核表达和纯化及纳米颗粒胞外自组装 被引量：3

10

作者 李志鹏 刘福航 +2 位作者 崔奎青 石德顺 刘庆友 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期75-82,共8页

旨在使用原核表达系统表达幽门螺杆菌铁蛋白Ferritin,获得具有天然纳米结构的铁蛋白纳米颗粒,从而通过表面修饰等方法应用于疾病治疗和抗原呈递等研究。将铁蛋白氨基酸序列按照大肠杆菌常用密码子进行优化,合成重组铁蛋白基因并克隆至... 旨在使用原核表达系统表达幽门螺杆菌铁蛋白Ferritin,获得具有天然纳米结构的铁蛋白纳米颗粒,从而通过表面修饰等方法应用于疾病治疗和抗原呈递等研究。将铁蛋白氨基酸序列按照大肠杆菌常用密码子进行优化,合成重组铁蛋白基因并克隆至原核表达载体。使用镍柱进行亲和层析纯化重组蛋白,并在透析复性后利用透射电子显微镜对体外自组装纳米颗粒进行鉴定。结果显示,本研究成功构建了pET-32a-Ferritin原核表达载体,并使用IPTG进行诱导表达获得His-Ferritin重组铁蛋白,且主要以包涵体形式存在。通过镍柱进行亲和层析纯化获得纯度为96%的重组蛋白,使用脱盐柱将重组蛋白梯度透析至2mol·L-1尿素缓冲液中进行复性后,使用电子显微镜观察胞外自组装重组蛋白为粒径在12~20nm的均一的纳米结构,与天然铁蛋白纳米粒子类似。本研究成功建立了Ferritin蛋白原核表达体系,通过诱导表达、亲和层析纯化及复性获得了具有天然纳米结构的铁蛋白纳米颗粒,为其在生物医药领域的应用奠定基础。 展开更多

关键词 铁蛋白 原核表达 亲和层析 胞外自组装

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一个水稻半矮化和花发育异常突变体的遗传分析和分子定位 被引量：2

11

作者 初志战 谢勇尧 +2 位作者 胡琛 郭海滨 刘耀光 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期910-915,共6页

从粳稻品种‘日本晴’经^(60)Co诱变的M_2代材料中发现一个半矮化并且花发育异常突变体sd-df3,其表现为植株半矮化,分蘖增加,半包茎穗,雄蕊发育不良,无花粉。遗传分析显示,该突变体表型受1对隐性核基因控制。以杂合型突变体为母本,与广... 从粳稻品种‘日本晴’经^(60)Co诱变的M_2代材料中发现一个半矮化并且花发育异常突变体sd-df3,其表现为植株半矮化,分蘖增加,半包茎穗,雄蕊发育不良,无花粉。遗传分析显示,该突变体表型受1对隐性核基因控制。以杂合型突变体为母本,与广亲和品种Dular杂交,构建F_2分离群体,将该基因定位在水稻第3号染色体,In/Del标记333591与333818之间的物理距离约为227kb的范围,目前该范围内没有矮化相关基因报道。 展开更多

关键词 水稻 半矮化并花发育异常 基因定位 遗传分析

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猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备 被引量：5

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作者 赵祥秀 黄茂发 +5 位作者 高跃美 唐榕泽 胡仁俊 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期3099-3108,共10页

【目的】制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础。【方法】利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a... 【目的】制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础。【方法】利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体。同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况。【结果】以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ。构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1∶16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期。此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好。【结论】制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持。 展开更多

关键词 IKKγ 猪瘟病毒(CSFV) 原核表达 真核表达 多克隆抗体

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水稻育性调控的分子遗传研究进展 被引量：10

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作者 谢勇尧 汤金涛 +3 位作者 杨博文 胡骏 刘耀光 陈乐天 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期703-715,共13页

杂交水稻为世界粮食安全做出了重要贡献。细胞质雄性不育和光/温敏不育分别是三系和两系杂交稻生产利用的遗传基础,而(亚)种间杂种不育则是杂交稻生产中要克服的主要技术瓶颈。因此,水稻育性调控是杂交水稻生产技术的关键,也是研究植物... 杂交水稻为世界粮食安全做出了重要贡献。细胞质雄性不育和光/温敏不育分别是三系和两系杂交稻生产利用的遗传基础,而(亚)种间杂种不育则是杂交稻生产中要克服的主要技术瓶颈。因此,水稻育性调控是杂交水稻生产技术的关键,也是研究植物核质互作和物种生殖隔离等基础科学问题的重要模型。我国植物遗传学家在阐明杂交水稻育性调控的分子遗传基础领域做出了重要贡献。本文回顾了我国杂交水稻的发展历程,系统总结了杂交水稻生产涉及的细胞质雄性不育与恢复、光/温敏不育与育性转换、杂种不育与亲和性的遗传基础和分子作用机制,探讨了我国杂交水稻生产存在的问题,指明了水稻杂种优势利用的发展方向。 展开更多

关键词 杂交稻 细胞质雄性不育 杂种不育 光/温敏不育 育性恢复

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猪TNF-α高效表达及其多克隆抗体的制备 被引量：4

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作者 黄茂发 梁晶晶 +5 位作者 赵祥秀 唐榕泽 高跃美 张文 罗廷荣 李晓宁 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期2572-2581,共10页

【目的】明确猪源肿瘤坏死因子α(TNF-α)多克隆抗体的特异性和反应性,并探索猪瘟病毒(CSFV)感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响,为揭示CSFV的致病机理打下基础。【方法】提取CSFV病料基因组RNA,通过RT-PCR扩增TNF-α基因,构建原核表达载... 【目的】明确猪源肿瘤坏死因子α(TNF-α)多克隆抗体的特异性和反应性,并探索猪瘟病毒(CSFV)感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响,为揭示CSFV的致病机理打下基础。【方法】提取CSFV病料基因组RNA,通过RT-PCR扩增TNF-α基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α并转化BL21感受态细胞诱导表达融合蛋白,经纯化和浓缩后免疫SPF级昆明小鼠制备TNF-α多克隆抗体;同时构建真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α,分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞表达融合蛋白,通过Western blotting、ELISA和间接免疫荧光分析等方法检测TNF-α多克隆抗体效价、反应性及特异性。【结果】以原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导后能表达出约43 kD的融合蛋白,且主要以包涵体形式进行表达。以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染HEK-293T细胞可表达出25 kD的融合蛋白,主要在细胞质中表达,且均匀分布。制备获得的TNF-α多克隆抗体能与转染HEK-293T细胞表达的融合蛋白TNF-α及PK-15细胞的内源蛋白TNF-α发生良好反应,即具有较好的反应特异性,其抗体效价高达1∶8000。CSFV能刺激PK-15细胞分泌蛋白TNF-α上调表达,且TNF-α与其下游因子(TRAF1)的表达变化趋势基本一致,即二者间存在一定关联性。【结论】制备获得的TNF-α蛋白抗体具有效价高、反应性好及特异性强的特点,可用于检测CSFV感染后真核细胞中过表达的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1产生,参与TRAF1相关信号通路而发挥其生物学功能,CSFV感染PK-15细胞后TNF-α和TRAF1的表达变化趋势基本一致,说明CSFV能刺激TNF-α和TRAF1信号通路,使机体产生炎症反应。 展开更多

关键词 猪 肿瘤坏死因子α(TNF-α) 多克隆抗体 猪瘟病毒(CSFV)

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ISG15蛋白泛素结合酶UBCH6的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：4

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作者 李玉霄 唐榕泽 +5 位作者 高跃美 冯佳佳 李晓泉 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 《动物医学进展》 北大核心 2020年第12期28-33,共6页

通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低... 通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低温条件下,用低浓度的IPTG诱导表达UBCH6重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,在30℃、用0.05 mmol/L IPTG诱导时UBCH6表达效果最好,而且UBCH6重组蛋白主要以可溶性的形式在菌液中表达。UBCH6重组蛋白经过Ni-NTA纯化后与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等体积混合乳化并免疫4周龄昆明小鼠,从而制备出UBCH6多克隆抗体,重组真核表达载体pcDNA3.0-UBCH6以化学转染人工脂质体法导入293T细胞中,Western blot检测制备的UBCH6多克隆抗体能与真核表达细胞蛋白发生反应,反应效价可达1∶10000,反应性良好。Western blot检测UBCH6多克隆抗体的特异性,ISG15多克隆抗体、UBCH6多克隆抗体都能与接毒CSFV、转染PolyI:C的PK-15细胞蛋白发生良好反应,且蛋白表达量与时间呈正相关。 展开更多

关键词 ISG15蛋白 UBCH6基因 多克隆抗体 猪瘟病毒 蛋白诱导表达

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猪STAT-1α基因的原核表达及其多克隆抗体制备 被引量：1

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作者 李延生 刘诚 +8 位作者 张珂 李晓宁 李晓泉 尹珊 谢琳娟 何晓霞 罗扬 钟桃珍 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期118-122,共5页

【目的】通过制备STAT-1α多克隆抗体,为进一步研究STAT-1α蛋白的功能特性及探索STAT-1α与猪瘟病毒间的相互作用机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR从猪肾PK-15细胞中克隆出STAT-1α基因保守片段,与pET-32a(+)构建原核表达重组质粒,转... 【目的】通过制备STAT-1α多克隆抗体,为进一步研究STAT-1α蛋白的功能特性及探索STAT-1α与猪瘟病毒间的相互作用机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR从猪肾PK-15细胞中克隆出STAT-1α基因保守片段,与pET-32a(+)构建原核表达重组质粒,转化原核宿主菌(Rosetta),进行IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经纯化和复性浓缩后,免疫小鼠制备STAT-1α多克隆抗体。【结果】STAT-1α基因能与原核表达载体pET-32a(+)构建原核表达重组质粒pET-STAT-1α,转化大肠杆菌Rosetta后的最佳体外诱导条件是IPTG 0.5 mmol/L、诱导时间6 h,其重组蛋白主要以包涵体的形式表达。STAT-1α多克隆抗体具有高效特异性,与真核细胞PK-15细胞作用后,在PK-15细胞内能检测到STAT-1α蛋白表达,可观察到大部分细胞胞浆内有绿色荧光,但胞核内几乎无荧光,即STAT-1α主要定位在正常PK-15细胞的细胞浆内表达。【结论】制备获得的猪STAT-1α多克隆抗体特异性好,既能与原核细胞大肠杆菌(Rosetta)表达的STAT-1α反应,又能与真核细胞PK-15的STAT-1α发生反应。 展开更多

关键词 猪 STAT-1α基因 原核表达 多克隆抗体

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猪MAVS基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

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作者 赵倩楠 应雪 +4 位作者 李晓泉 张珂 李晓宁 梁晶晶 罗廷荣 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2017年第4期39-42,共4页

通过RT-PCR从PK-15细胞系中扩增克隆MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因,构建原核表达载体p ET-MAVS220,转化感受态细胞Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达,重组MAVS经纯化后免疫4周龄昆明系小鼠制备抗线粒体抗病病毒信... 通过RT-PCR从PK-15细胞系中扩增克隆MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因,构建原核表达载体p ET-MAVS220,转化感受态细胞Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达,重组MAVS经纯化后免疫4周龄昆明系小鼠制备抗线粒体抗病病毒信号蛋白(MAVS)多克隆抗体。诱导表达的最佳条件为IPTG 0.05 mmol/L,37℃诱导6 h,重组MAVS以可溶性蛋白和包涵体两种形式表达。应用该重组蛋白免疫小鼠获得的抗MAVS多克隆抗体与纯化的重组MAVS蛋白反应效价可达1∶16 000;该抗体与Poly(I∶C)刺激PK-15细胞产生的MAVS及与转染了重组MAVS基因真核表达载体pcDNA3.0-MAVS的BHK-21细胞表达的MAVS蛋白发生特异性反应,效价可达1∶1 000,特异性良好。 展开更多

关键词 猪MAVS 原核表达 多克隆抗体

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