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构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒
1
作者
梅芬
李瑞玮
+4 位作者
张娟娟
左荣霞
邹云莲
沈涛
撒亚莲
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第3期110-114,共5页
旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α...
旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。
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关键词
ALOX5
CRISPR/Cas9
基因敲除
构建
质粒
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职称材料
题名
构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒
1
作者
梅芬
李瑞玮
张娟娟
左荣霞
邹云莲
沈涛
撒亚莲
机构
昆明理工大学附属
医院
云南省
第一
人民医院
临床基础医学研究所
云南省
出生缺陷与
遗传
病研究重点实验室
云南省
临床病毒学重点实验室
华中
科
技大学同济医学院
生殖
医学中心(武汉同济
生殖
医学专
科
医院
)
云南省第三人民医院生殖遗传科
出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第3期110-114,共5页
基金
国家自然科学基金项目(31460298)
云南省卫生厅内设机构资助项目(2016NS225)
云南省科技厅-昆医联合专项(2015FB102)
文摘
旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。
关键词
ALOX5
CRISPR/Cas9
基因敲除
构建
质粒
Keywords
ALOX5
CRISPR/Cas9
gene knock out
construction
plasmids
分类号
R733.7 [医药卫生—肿瘤]
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作者
出处
发文年
被引量
操作
1
构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒
梅芬
李瑞玮
张娟娟
左荣霞
邹云莲
沈涛
撒亚莲
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2020
0
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