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人源有机阴离子转运多肽1B1和多药耐药相关蛋白2双转MDCKⅡ细胞株的构建及其功能验证
被引量：
1
1
作者
胡楠
马国
杨青
《复旦学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第2期134-142,共9页
目的构建人源有机阴离子转运多肽1B1(human organic anion transporting polypeptide 1B1,hOATP1B1)和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein2,hMRP2)双转MDCKⅡ细胞株,验证其功能,并应用其考察创新药物2,3-双加...
目的构建人源有机阴离子转运多肽1B1(human organic anion transporting polypeptide 1B1,hOATP1B1)和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein2,hMRP2)双转MDCKⅡ细胞株,验证其功能,并应用其考察创新药物2,3-双加氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan,1-MT)的转运特性。方法采用基因工程手段获得hOATP1B1和hMRP2表达真核载体pVITRO2-SLCO1B1-ABCC2,转染MDCKⅡ细胞,通过遗传霉素G418筛选得到稳定表达的细胞株;通过Realtime PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜确认目的蛋白特异性;利用该双转模型考察普伐他汀(不同pH环境和不同底物浓度)和1-MT的转运。结果经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明重组质粒构建成功;通过Real-time PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜证明经遗传霉素筛选的MDCK-OATP1B1/MRP2细胞构建成功;pH=6.5时,普伐他汀在所构建双转细胞模型上转运最佳;在0~500μmol/L的浓度范围内,普伐他汀在该模型上的转运呈现浓度依赖性。1-MT在该细胞模型上无明显转运。结论成功构建人源MDCKOATP1B1/MRP2双转细胞株,发现1-MT既不是OATP1B1蛋白也不是MRP2蛋白的底物,该细胞株可用于OATP1B1/MRP2介导的外源性物质(如药物)和内源性物质(如胆红素)的转运研究。
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关键词
有机阴离子转运多肽1B1
多药耐药相关蛋白2
MDCKⅡ
普伐他汀
1-甲基色氨酸
转运
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职称材料
人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2的表达与纯化
被引量：
1
2
作者
李娟娟
李洋
杨青
《复旦学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第4期401-408,共8页
目的构建人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2(human indoleamine 2,3-dioxygenase-2,hIDO2)原核表达载体,表达、纯化获得hIDO2蛋白。方法采用基因工程手段获得hIDO2原核表达载体并转化表达菌株,筛选合适的重组质粒及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(iso...
目的构建人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2(human indoleamine 2,3-dioxygenase-2,hIDO2)原核表达载体,表达、纯化获得hIDO2蛋白。方法采用基因工程手段获得hIDO2原核表达载体并转化表达菌株,筛选合适的重组质粒及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)浓度进行蛋白表达;通过亲和层析纯化重组hIDO2,BCA法测定蛋白浓度并计算蛋白收率;SDS-PAGE电泳检测hIDO2表达情况,通过软件分析得到蛋白纯度;Western blot检测目的蛋白特异性。结果重组质粒经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明构建成功;经筛选发现重组质粒pET28a-hIDO2比pGEX-4T-1-hIDO2的hIDO2表达效果好;SDS-PAGE电泳及Western blot均验证了在相对分子质量45 000处的特异性目的条带的存在;经测定及计算得出蛋白纯度为97.1%,蛋白浓度为20 mg/mL,蛋白收率为15 mg/L。结论成功构建重组质粒用于表达及纯化hIDO2,蛋白浓度、纯度、收率及特异性均较高。
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关键词
吲哚胺2
3-双加氧酶-2
人源
蛋白表达
蛋白纯化
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职称材料
鼠源吲哚胺2,3-双加氧酶活性检测方法的建立
3
作者
郭占领
李娟娟
杨青
《复旦学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第3期350-356,共7页
目的建立鼠源吲哚胺2,3-双加氧酶(mouse indoleamine 2,3-dioxygenase,mIDO)活性检测方法。方法利用基因工程方法表达纯化重组mIDO(recombinant mIDO,rmIDO),建立酶水平mIDO活性检测体系;构建过表达mIDO的小鼠Lewis肺癌(Lewis lung canc...
目的建立鼠源吲哚胺2,3-双加氧酶(mouse indoleamine 2,3-dioxygenase,mIDO)活性检测方法。方法利用基因工程方法表达纯化重组mIDO(recombinant mIDO,rmIDO),建立酶水平mIDO活性检测体系;构建过表达mIDO的小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer,LLC)细胞株,建立细胞水平mIDO活性检测体系。比较L-1-甲基色氨酸(L-1-methyl tryptophan,L-1-MT)在酶及细胞水平上对mIDO及人源IDO(human IDO,hIDO)的抑制作用,测定抑制类型、抑制常数Ki值及半数抑制浓度(IC50)值。结果 L-1-MT对mIDO和hIDO均有抑制作用,抑制类型及抑制常数Ki值相似,但IC50值在酶水平及细胞水平上均有差异。结论 mIDO酶活性检测体系是筛选IDO抑制剂的有效工具,与hIDO酶活性检测体系联用,能反映种属差异,可更好地利用小鼠模型来替代人类进行IDO抑制剂治疗疾病的研究。
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关键词
吲哚胺2
3-双加氧酶
鼠源
人源
活性检测体系
L-1-甲基色氨酸
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职称材料
题名
人源有机阴离子转运多肽1B1和多药耐药相关蛋白2双转MDCKⅡ细胞株的构建及其功能验证
被引量：
1
1
作者
胡楠
马国
杨青
机构
复旦大学生命科学学院
生物
化学系
复旦大学药学院临床药学教研室
云南天然产物与生物制药协同创新中心
出处
《复旦学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第2期134-142,共9页
基金
国家自然科学基金面上项目(81573310
81374051)
高等学校博士学科点专项科研基金(20130071110037)~~
文摘
目的构建人源有机阴离子转运多肽1B1(human organic anion transporting polypeptide 1B1,hOATP1B1)和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein2,hMRP2)双转MDCKⅡ细胞株,验证其功能,并应用其考察创新药物2,3-双加氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan,1-MT)的转运特性。方法采用基因工程手段获得hOATP1B1和hMRP2表达真核载体pVITRO2-SLCO1B1-ABCC2,转染MDCKⅡ细胞,通过遗传霉素G418筛选得到稳定表达的细胞株;通过Realtime PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜确认目的蛋白特异性;利用该双转模型考察普伐他汀(不同pH环境和不同底物浓度)和1-MT的转运。结果经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明重组质粒构建成功;通过Real-time PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜证明经遗传霉素筛选的MDCK-OATP1B1/MRP2细胞构建成功;pH=6.5时,普伐他汀在所构建双转细胞模型上转运最佳;在0~500μmol/L的浓度范围内,普伐他汀在该模型上的转运呈现浓度依赖性。1-MT在该细胞模型上无明显转运。结论成功构建人源MDCKOATP1B1/MRP2双转细胞株,发现1-MT既不是OATP1B1蛋白也不是MRP2蛋白的底物,该细胞株可用于OATP1B1/MRP2介导的外源性物质(如药物)和内源性物质(如胆红素)的转运研究。
关键词
有机阴离子转运多肽1B1
多药耐药相关蛋白2
MDCKⅡ
普伐他汀
1-甲基色氨酸
转运
Keywords
organic anion transporting polypeptide 1B1 multidrug resistance-associated protein 2 Madin-Darby canine kidney Ⅱ pravastatin
1-methyltryptophan
transport
分类号
R965.1 [医药卫生—药理学]
Q233 [生物学—细胞生物学]
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职称材料
题名
人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2的表达与纯化
被引量：
1
2
作者
李娟娟
李洋
杨青
机构
复旦大学生命科学学院
生物
化学系
云南天然产物与生物制药协同创新中心
出处
《复旦学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第4期401-408,共8页
基金
国家自然科学基金(81373396
81573310)
高等学校博士学科点专项科研基金(20130071110037)~~
文摘
目的构建人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2(human indoleamine 2,3-dioxygenase-2,hIDO2)原核表达载体,表达、纯化获得hIDO2蛋白。方法采用基因工程手段获得hIDO2原核表达载体并转化表达菌株,筛选合适的重组质粒及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)浓度进行蛋白表达;通过亲和层析纯化重组hIDO2,BCA法测定蛋白浓度并计算蛋白收率;SDS-PAGE电泳检测hIDO2表达情况,通过软件分析得到蛋白纯度;Western blot检测目的蛋白特异性。结果重组质粒经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明构建成功;经筛选发现重组质粒pET28a-hIDO2比pGEX-4T-1-hIDO2的hIDO2表达效果好;SDS-PAGE电泳及Western blot均验证了在相对分子质量45 000处的特异性目的条带的存在;经测定及计算得出蛋白纯度为97.1%,蛋白浓度为20 mg/mL,蛋白收率为15 mg/L。结论成功构建重组质粒用于表达及纯化hIDO2,蛋白浓度、纯度、收率及特异性均较高。
关键词
吲哚胺2
3-双加氧酶-2
人源
蛋白表达
蛋白纯化
Keywords
indoleamine 2
3-dioxygenasse-2
human
protein expression
protein purification
分类号
Q331 [生物学—遗传学]
Q786 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
鼠源吲哚胺2,3-双加氧酶活性检测方法的建立
3
作者
郭占领
李娟娟
杨青
机构
复旦大学生命科学学院
生物
化学系
云南天然产物与生物制药协同创新中心
出处
《复旦学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第3期350-356,共7页
基金
国家自然科学基金(81373396)
高等学校博士学科点专项科研基金(20130071110037)
上海市科委生物医药重点课题(12431900204)~~
文摘
目的建立鼠源吲哚胺2,3-双加氧酶(mouse indoleamine 2,3-dioxygenase,mIDO)活性检测方法。方法利用基因工程方法表达纯化重组mIDO(recombinant mIDO,rmIDO),建立酶水平mIDO活性检测体系;构建过表达mIDO的小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer,LLC)细胞株,建立细胞水平mIDO活性检测体系。比较L-1-甲基色氨酸(L-1-methyl tryptophan,L-1-MT)在酶及细胞水平上对mIDO及人源IDO(human IDO,hIDO)的抑制作用,测定抑制类型、抑制常数Ki值及半数抑制浓度(IC50)值。结果 L-1-MT对mIDO和hIDO均有抑制作用,抑制类型及抑制常数Ki值相似,但IC50值在酶水平及细胞水平上均有差异。结论 mIDO酶活性检测体系是筛选IDO抑制剂的有效工具,与hIDO酶活性检测体系联用,能反映种属差异,可更好地利用小鼠模型来替代人类进行IDO抑制剂治疗疾病的研究。
关键词
吲哚胺2
3-双加氧酶
鼠源
人源
活性检测体系
L-1-甲基色氨酸
Keywords
indoleamine 2
3-dioxygenase
mouse
human
activity assay system
L-1-methyl tryptophan
分类号
Q331 [生物学—遗传学]
Q786 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
人源有机阴离子转运多肽1B1和多药耐药相关蛋白2双转MDCKⅡ细胞株的构建及其功能验证
胡楠
马国
杨青
《复旦学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2017
1
在线阅读
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职称材料
2
人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2的表达与纯化
李娟娟
李洋
杨青
《复旦学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2016
1
在线阅读
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职称材料
3
鼠源吲哚胺2,3-双加氧酶活性检测方法的建立
郭占领
李娟娟
杨青
《复旦学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2016
0
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职称材料
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