人脐带间充质干细胞来源外泌体的生物学特性研究 被引量：15

1

作者 杨向荣 丁娟 +3 位作者 徐正阳 王珏 纪红梅 李玉云 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期154-159,共6页

目的探讨正常人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stromal cells,hUC-MSCs）分泌的外泌体（exosomes）的免疫调节功能及对恶性肿瘤细胞体外增殖的影响。方法采用组织贴壁法分离培养hUC-MSCs,收集第3~6代hUC-MSCs上清... 目的探讨正常人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stromal cells,hUC-MSCs）分泌的外泌体（exosomes）的免疫调节功能及对恶性肿瘤细胞体外增殖的影响。方法采用组织贴壁法分离培养hUC-MSCs,收集第3~6代hUC-MSCs上清液,使用超速离心法分离纯化exosomes;通过电子显微镜观察exosomes形态并分析其直径和直径分布范围等特征;采用流式细胞仪检测其表面hUC-MSCs来源的CD44、CD73标志物。将exosomes与正常人外周血单个核细胞共培养,采用MTT检测exosomes对淋巴细胞增殖的影响,ELISA法检测上清液中IL-4和INF-γ的分泌量。选择慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞株,加入exosomes共培养,应用MTT法、PI/AnnexinⅤ双染流式法检测exosomes对癌细胞体外生长增殖、凋亡的影响。结果组织贴壁法成功分离hUC-MSCs,传代后呈长梭状生长。电镜观察分离得到的exosomes为椭圆形膜性小囊泡,经统计得出其直径在6.8~78.1nm之间,且分布比较集中。流式细胞术测得exosomes高表达黏附分子CD44（54.1%）与干细胞标志物CD73（31.5%）,MTT和ELISA检测结果表明,不同浓度的exosomes均抑制外周血单个核细胞增殖且抑制细胞因子IL-4和INF-γ的分泌,呈现剂量依赖性。体外实验表明exosomes对K562细胞株具有抑制增殖、促进凋亡的作用。结论 hUC-MSCs来源的exosomes具有免疫调节作用及抑制K562细胞增殖的作用。 展开更多

关键词 间充质干细胞 外泌体 免疫调节 增殖 凋亡

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三七总皂苷抑制K562细胞mTOR信号通路活性的实验研究 被引量：3

2

作者 翟玮玮 李玉云 +3 位作者 杨向荣 于北凯 王露 李见 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1237-1242,共6页

目的探讨三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对体外培养K562细胞m TOR信号通路相关分子表达及活性的影响。方法不同浓度的PNS（50~800μg/m L）干预体外培养K562细胞24~72 h后,MTT比色法检测PNS对K562细胞增殖的抑制作用;AO... 目的探讨三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对体外培养K562细胞m TOR信号通路相关分子表达及活性的影响。方法不同浓度的PNS（50~800μg/m L）干预体外培养K562细胞24~72 h后,MTT比色法检测PNS对K562细胞增殖的抑制作用;AO/EB双荧光染色法观察细胞死亡及凋亡状况;RT-PCR检测m TOR、p70S6K、4E-BP1 mRNA表达变化;Western blot检测m TOR、p70S6K、4E-BP1及p-m TOR、p-p70S6K、p-4E-BP1蛋白表达量的变化。结果与对照组相比,浓度为100~800μg/m L的PNS能够抑制K562细胞增殖（P〈0.05）,促进K562细胞凋亡及死亡（P〈0.05）,PNS对K562细胞72 h的IC50为（229.07±2.36）μg/m L;100、200、400μg/m L PNS作用于K562细胞72 h后m TOR蛋白表达量及mRNA表达量降低（P〈0.05）,且磷酸化蛋白p-m TOR（Ser2448）、p-p70S6K（Thr229/389）及p-4E-BP1（Thr37/46）表达水平也随着药物浓度的增加而降低（P〈0.05）。结论 PNS能够抑制K562细胞m TOR信号通路的活性,这可能是PNS抑制K562细胞增殖的机制之一。 展开更多

关键词 三七总皂苷 K562细胞 M TOR信号通路

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RNA干扰技术沉默MMP-9基因对THP-1细胞影响的实验研究 被引量：2

3

作者 禹莉 凌云志 +4 位作者 肖霄 韩昂轩 彭柯 徐鹏琛 高乾乾 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1069-1073,共5页

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)MMP-9基因对THP-1细胞增殖的抑制作用。探讨RNA干扰MMP-9基因在白血病治疗中的应用。方法:设计合成针对MMP-9基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染THP-1细胞,采用RT-PCR法测定MMP... 目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)MMP-9基因对THP-1细胞增殖的抑制作用。探讨RNA干扰MMP-9基因在白血病治疗中的应用。方法:设计合成针对MMP-9基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染THP-1细胞,采用RT-PCR法测定MMP-9 mRNA的表达,Western blot测定MMP-9蛋白的表达,MTT和台盼蓝染色观察RNAi后对THP-1细胞生长的影响,显微镜下观察细胞形态改变。结果:siRNA转染组THP-1细胞MMP-9 mRNA及蛋白表达受到抑制,显著低于空白对照组和阴性对照组。MTT及台盼蓝染色结果显示,siRNA组转染后48 h、72 h,THP-1细胞的增殖能力明显下降,细胞生长明显受到抑制,细胞活率明显低于对照组(P<0.05)。倒置显微镜下发现,对照组细胞呈半贴壁生长,细胞轮廓清楚,形态均一,生长旺盛。而siRNA组细胞生长呈受抑制状态,Wright染色后观察,siRNA组细胞形态有明显改变,大部分细胞出现凋亡的形态学变化。结论:靶向MMP-9的siRNA不仅能特异性降低MMP-9 mRNA及蛋白的表达,且能有效抑制THP-1细胞的增殖,促进THP-1细胞凋亡。 展开更多

关键词 RNA干扰 MMP-9 THP-1细胞

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IDO基因重组慢病毒载体构建及其转染hUCMSCs细胞的实验研究

4

作者 李玉云 李见 +3 位作者 王露 翟玮玮 吴正中 张强 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期395-400,423,共7页

目的构建共同表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体,探讨其在人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)中的表达,为下一步利用高表达IDO的hUCMSCs移植治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法将IDO基因... 目的构建共同表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体,探讨其在人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)中的表达,为下一步利用高表达IDO的hUCMSCs移植治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法将IDO基因克隆至慢病毒pGC-FU-EGFP表达载体中,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。重组慢病毒表达载体质粒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;制备携带IDO基因的慢病毒Lentivirus-IDO,并测定重组慢病毒的滴度。用重组慢病毒以最佳MOI值感染hUCM-SCs作为实验组,以空载体转染的hUCMSCs(空载体组)及未转染的hUCMSCs(未转染组)作为对照,应用RT-PCR及Western blot法分别检测细胞中IDO mRNA及IDO蛋白水平的表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定pGC-FU-EGFP-IDO重组慢病毒表达载体构建成功,包装慢病毒Lentivirus-IDO滴度为2×108 TU/mL。通过EGFP表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为30,此时对细胞的转染效率可达到80%以上。RT-PCR检测显示实验组IDO mRNA表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性;Western blot检测示实验组细胞内IDO蛋白表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性。结论成功构建了人IDO基因的重组慢病毒表达载体,慢病毒Lentivirus-IDO能有效感染hUCMSCs,IDO蛋白可在hUCMSCs中长期、稳定表达。 展开更多

关键词 再生障碍性贫血 人脐带间充质干细胞 吲哚胺2 3-过氧化酶 绿色荧光蛋白 慢病毒载体

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葡萄籽提取物通过抑制Survivin的表达而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖 被引量：4

5

作者 陈昌杰 刘臣彪 +2 位作者 杨清玲 章菊 藤风猛 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期955-959,共5页

目的观察GSE对乳腺癌细胞增殖的影响及其作用的分子信号途径,为寻找新的乳腺癌临床治疗药物奠定一定的理论基础。方法倒置显微镜观察不同浓度GSE作用后MCF-7细胞生长的形态学变化;PI单染后流式细胞仪检测MCF-7细胞的周期改变;半定量RT-... 目的观察GSE对乳腺癌细胞增殖的影响及其作用的分子信号途径,为寻找新的乳腺癌临床治疗药物奠定一定的理论基础。方法倒置显微镜观察不同浓度GSE作用后MCF-7细胞生长的形态学变化;PI单染后流式细胞仪检测MCF-7细胞的周期改变;半定量RT-PCR观察Survivin mRNA的表达;Western blot检测Survivin和Caspase-3的蛋白表达变化;荧光素酶试剂盒检测Survivin核心启动子的活性;半定量RT-PCR观察与Survivin核心启动子活性相关的转录因子Sp1、E2F-1和HIF-1α的表达变化。结果经GSE作用24h后,MCF-7细胞形态发生改变,细胞变圆、脱壁,并聚集成团;细胞生长周期发生改变,细胞阻滞于S期,G2/M期细胞明显减少;Survivin mRNA表达降低,Survivin蛋白表达减少;Caspase-3蛋白有活性片段产生;Survivin核心启动子活性明显降低,与其活性相关的转录因子Sp1、HIF-1α mRNA表达降低,E2F-1 mRNA表达升高。结论GSE通过调节Survivin核心启动子活性相关转录因子的表达而抑制Sur-vivin核心启动子的活性,下调Survivin基因的表达同时激活Caspase-3蛋白的活性,抑制了乳腺癌MCF-7细胞的生长,同时可能还诱导了肿瘤细胞的凋亡。 展开更多

关键词 葡萄籽提取物 乳腺癌 SURVIVIN Survivin核心启动子 转录因子 CASPASE-3

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神经生长因子受体TrkA和p75在乳腺肿瘤中的表达及意义 被引量：7

6

作者 杨清玲 陈昌杰 +1 位作者 高艳军 章菊 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期423-428,共6页

目的观察神经生长因子(NGF)受体TrkA和p75在乳腺肿瘤和不同乳腺癌细胞株的表达情况,分析它们与乳腺肿瘤的相关性及TrkA/p75比值对NGF诱导增殖效应的影响。方法采用免疫组化技术检测15例正常乳腺组织、28例乳腺良性肿瘤和62例乳腺恶性肿... 目的观察神经生长因子(NGF)受体TrkA和p75在乳腺肿瘤和不同乳腺癌细胞株的表达情况,分析它们与乳腺肿瘤的相关性及TrkA/p75比值对NGF诱导增殖效应的影响。方法采用免疫组化技术检测15例正常乳腺组织、28例乳腺良性肿瘤和62例乳腺恶性肿瘤中TrkA和p75的表达及乳腺癌细胞株MCF-7和SKBR3中NGF、TrkA和p75的表达,采用实时荧光定量PCR技术检测2种细胞株中TrkA和p75的mRNA表达水平,采用MTT检测2种细胞株对NGF诱导增殖的反应。结果 TrkA在乳腺恶性肿瘤中的表达高于乳腺良性肿瘤和正常乳腺组织(χ2=39.98,P<0.01);p75仅在正常乳腺的肌上皮细胞和结缔组织中高表达,随着肿瘤的恶性程度增高,p75的表达逐渐减少最终缺失(χ2=50.96,P<0.01);SKBR3乳腺癌细胞分泌的NGF,表达的TrkA和p75 mRNA及蛋白水平均高于MCF-7细胞(均P<0.05),并且SKBR3细胞表达的TrkA/p75比值高于MCF-7细胞(P<0.05);相对于空白对照组,NGF可诱导SKBR3和MCF-7细胞的增殖(均P<0.05),并在各时点,NGF对SKBR3细胞诱导的增殖率均高于MCF-7细胞(均P<0.05)。结论 TrkA和p75的表达与乳腺肿瘤的恶性程度有关,有可能作为乳腺癌治疗的分子靶点。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤 神经生长因子 TRKA P75 细胞增殖

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奥沙利铂对肝癌细胞HuH-7细胞周期的影响 被引量：11

7

作者 高洁 吴穷 +2 位作者 杨清玲 高艳军 陈昌杰 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期445-449,共5页

目的探讨奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)对人肝癌细胞株HuH-7细胞周期的影响及其相关机制,为其应用于原发性肝细胞癌临床治疗提供理论依据。方法 MTT方法检测L-OHP对肝癌细胞HuH-7生长的抑制作用;流式细胞术(FCM)检测L-OHP诱导HuH-7细胞... 目的探讨奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)对人肝癌细胞株HuH-7细胞周期的影响及其相关机制,为其应用于原发性肝细胞癌临床治疗提供理论依据。方法 MTT方法检测L-OHP对肝癌细胞HuH-7生长的抑制作用;流式细胞术(FCM)检测L-OHP诱导HuH-7细胞周期阻滞的作用;RT-PCR和Western blot方法观察L-OHP对细胞周期调节因子Cyclin D1、CDK2、CDK4及p16、p21、p53表达的影响。结果 MTT结果显示L-OHP对HuH-7细胞增殖抑制率随药物浓度增加及作用时间延长有升高趋势,呈时间剂量依赖性。L-OHP能够诱导HuH-7细胞周期阻滞于S期,并可下调CDK4和Cyclin D1蛋白的表达,上调p21蛋白的表达,低浓度上调p53表达而高浓度下调p53表达,CDK2和p16表达无明显变化。结论 L-OHP可能通过影响CDK4、Cyclin D1及p21的活性使HuH-7细胞阻滞在S期,从而抑制肝癌细胞HuH-7的增殖。 展开更多

关键词 奥沙利铂 细胞周期 肝癌

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长链非编码RNA RP11-770J1.3和跨膜蛋白25对紫杉醇耐药人乳腺癌细胞株耐药性的影响 被引量：5

8

作者 李钰 王月月 +5 位作者 王海凤 张凌宇 丁勇兴 陈素莲 杨清玲 陈昌杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期364-370,共7页

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)RP11-770J1.3和跨膜蛋白25(TMEM25)对紫杉醇耐药人乳腺癌细胞株耐药性的影响。方法:利用实时定量PCR检测lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25在人乳腺癌细胞MCF-7和紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/PR)中的表达。在MCF-7... 目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)RP11-770J1.3和跨膜蛋白25(TMEM25)对紫杉醇耐药人乳腺癌细胞株耐药性的影响。方法:利用实时定量PCR检测lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25在人乳腺癌细胞MCF-7和紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/PR)中的表达。在MCF-7/PR中转染lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的干扰片段,磺酰罗丹明B法检测MCF-7/PR对紫杉醇药物敏感性的变化,并运用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测多药耐药相关蛋白(MRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、多药耐药基因1(MDR1)及其编码产物P-gp mRNA和蛋白水平的改变。结果:lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25在MCF-7/PR中表达上调(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组和紫杉醇阴性对照组比较,干扰lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的表达可以提高MCF-7/PR对紫杉醇的药物敏感性,并下调耐药相关基因MRP、BCRP、MDR1及其编码产物P-gp的表达(均P<0.05);与单独干扰lncRNA RP11-770J1.3或TMEM25比较,同时干扰lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的作用更加明显(P<0.05)。结论:MCF-7/PR中lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的表达上调,联合干扰lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的表达可以提高MCF-7/PR对紫杉醇的敏感性。 展开更多

关键词 RNA 膜蛋白质类/代谢 乳腺肿瘤/病理生理 聚合酶链反应 紫杉 酚/药理学 细胞系 肿瘤/病理学 肿瘤细胞 培养的 抗药性 肿瘤

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慢病毒介导RNA干扰沉默Fas基因在脐带间充质干细胞中的表达 被引量：10

9

作者 王露 翟玮玮 +4 位作者 杨向荣 王芳 李见 张强 李玉云 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1475-1480,共6页

目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,构建Fas基因的siRNA慢病毒表达载体,建立Fas基因稳定干扰的人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)株,为下一步使用低表达Fas基因的UC-MSCs治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法以人Fas基因mRNA序列作为干扰靶点... 目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,构建Fas基因的siRNA慢病毒表达载体,建立Fas基因稳定干扰的人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)株,为下一步使用低表达Fas基因的UC-MSCs治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法以人Fas基因mRNA序列作为干扰靶点,设计4组靶向Fas的shRNA序列,合成寡核苷酸,与经过BamHI、EcoRI双酶切后的LV3载体连接获得重组慢病毒,通过感染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养人UC-MSCs,使用包装好的慢病毒感染UCMSCs,应用Real time-PCR和Western blotting检测感染后细胞中Fas mRNA及蛋白的表达情况。结果经酶切以及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,病毒悬液滴度为3×108TU/ml。Real time-PCR和Western blotting结果显示干扰组细胞的Fas表达水平较对照组显著降低。结论慢病毒介导的SiRNA能有效沉默UC-MSCs中Fas基因的表达。 展开更多

关键词 慢病毒 SIRNA FAS 脐带间充质干细胞

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化疗抑制下骨髓BMP4对造血干/祖细胞周期、凋亡的调控及其机制 被引量：4

10

作者 徐正阳 柴烁 +4 位作者 张小晴 曹蕴 连超群 武文娟 李玉云 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期1265-1271,共7页

目的:探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的骨髓抑制或应激造血条件下骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein4,BMP4)对造血干/祖细胞(HSPC)的周期、凋亡调控的作用及其相关机制。方法:设计构建BMP4过表达的C57BL/6转基因小鼠(transgenec gr... 目的:探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的骨髓抑制或应激造血条件下骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein4,BMP4)对造血干/祖细胞(HSPC)的周期、凋亡调控的作用及其相关机制。方法:设计构建BMP4过表达的C57BL/6转基因小鼠(transgenec group),选取周龄、性别、体重相匹配的野生型(WT)雌鼠为对照组,各实验重复3次。5-FU以150mg/kg的剂量诱导骨髓抑制模型,提取骨髓有核细胞。通过c-kit/Sca-1荧光抗体双标HSPC,分别用AnnexinV/PI和Ki-67/DAPI双染法观察其凋亡和细胞周期的变化。RT-g-PCR检测周期相关的造血调控因子,探讨BMP4调控HSPC细胞周期的分子机制。结果:生理状态下,野生型组和转基因组HSPC细胞周期和凋亡率无明显差异。骨髓抑制后,BMP4过表达小鼠骨髓中HSPC的G0期比例明显降低(P<0.01),凋亡率明显上升(P<0.05)。BMP4过表达小鼠骨髓基质中维持HSPC静息的低氧诱导因子Hif-1α和趋化因子CXCL12水平明显下调(P<0.01)。结论:在造血应激或骨髓抑制等非生理条件下,BMP4蛋白上调能促进HSPC进入细胞周期,促进其凋亡,且可能通过直接或间接下调Hif-1α和CXCL12表达来发挥对HSPC的周期调控功能。 展开更多

关键词 骨形态发生蛋白4 造血干/祖细胞 凋亡 细胞周期 小鼠

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原花青素上调let-7a抑制胰腺癌AsPC-1细胞生长及迁移 被引量：5

11

作者 马佳 方斌斌 +3 位作者 马聪 庞海杰 曾凡鹏 夏俊 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1110-1115,共6页

目的探讨原花青素是否通过上调let-7a表达而抑制胰腺癌细胞生长及迁移。方法体外培养人胰腺癌As PC-1细胞,原花青素处理细胞后,分别用MTT法、Annexin V-FITC/PI双染及Transwell迁移等实验检测细胞增殖率、细胞凋亡率及细胞迁移能力的改... 目的探讨原花青素是否通过上调let-7a表达而抑制胰腺癌细胞生长及迁移。方法体外培养人胰腺癌As PC-1细胞,原花青素处理细胞后,分别用MTT法、Annexin V-FITC/PI双染及Transwell迁移等实验检测细胞增殖率、细胞凋亡率及细胞迁移能力的改变;利用mi RNA实时逆转录PCR检测细胞内let-7a表达变化。As PC-1细胞转染let-7a mimics后,MTT法、Transwell迁移实验分别检测细胞增殖率及细胞迁移能力的改变。结果与对照组相比,原花青素处理As PC-1细胞后,细胞增殖率、细胞迁移能力随着原花青素浓度升高而下降,而细胞凋亡率随着药物浓度升高而逐渐升高。与对照组相比,原花青素处理细胞后,let-7a的表达升高。通过脂质体转染let-7a mimics后,细胞的增殖率及迁移能力均低于对照组,且let-7a mimics与原花青素共同作用后,细胞增殖及迁移明显低于let-7a mimics和原花青素单独作用组。结论原花青素具有抑制胰腺癌细胞生长、迁移,及诱导细胞凋亡的作用。原花青素可能是通过上调let-7a表达,从而抑制胰腺癌细胞的生长及迁移。 展开更多

关键词 原花青素 let-7a 胰腺癌细胞

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CXC趋化因子受体4通过S期激酶相关蛋白2调控乳腺癌细胞周期的机制 被引量：5

12

作者 王海凤 陈天天 +7 位作者 王月月 李钰 张凌宇 丁勇兴 陈素莲 王文锐 杨清玲 陈昌杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期357-363,共7页

目的:探讨CXC趋化因子受体4(CXCR4)通过PI3K/Akt和ERK信号通路调控S期激酶相关蛋白2(Skp2)的表达,进而影响乳腺癌细胞周期的机制。方法:利用干扰及过表达技术下调或上调CXCR4的表达后,通过实时定量PCR和蛋白质印迹法检测CXCR4与Skp2调... 目的:探讨CXC趋化因子受体4(CXCR4)通过PI3K/Akt和ERK信号通路调控S期激酶相关蛋白2(Skp2)的表达,进而影响乳腺癌细胞周期的机制。方法:利用干扰及过表达技术下调或上调CXCR4的表达后,通过实时定量PCR和蛋白质印迹法检测CXCR4与Skp2调控的关联性;蛋白质印迹法检测CXCR4干扰及过表达后对信号蛋白及Skp2下游相关基因表达的影响;通过碘化丙啶(PI)染色法检测CXCR4、PI3K/Akt通路抑制剂LY294002及ERK通路抑制剂U0126对乳腺癌细胞周期的影响。结果:干扰CXCR4后,Skp2表达下调;过表达CXCR4后,Skp2表达上调。CXCR4可通过对信号蛋白的调控影响Skp2及Skp2下游相关基因的表达。干扰CXCR4后,G_0/G_1期细胞比例增加,S期细胞比例相应减少,CXCR4与LY294002及U0126联合作用对细胞周期的阻断更加明显。结论:CXCR4能够通过对信号蛋白PI3K/Akt及ERK的调控,影响Skp2及Skp2下游相关基因的表达,阻断CXCR4/Akt/Skp2或CXCR4/ERK/Skp2信号通路后可有效诱导细胞周期阻滞,从而抑制乳腺癌细胞的增殖。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤/病理生理学 受体 CXCR4/生物合成 受体 CXCR4/遗传学 S期激酶相关蛋白质类/代谢 细胞系 肿瘤/代谢 细胞增殖 细胞周期

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生长停滞特异性转录本5在乳腺癌中低表达并抑制上皮细胞-间充质转化 被引量：12

13

作者 丁勇兴 段克才 陈素莲 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期1427-1435,共9页

目的探讨生长停滞特异性转录本5(lncRNA-GAS5)在乳腺癌中发展和上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中的影响。方法采用实时定量聚合酶链反应法检测乳腺癌组织和癌旁组织(n=36)、乳腺癌MCF-7亲本和耐药细胞中lncRNA-GAS5的表达,并分析GAS5表... 目的探讨生长停滞特异性转录本5(lncRNA-GAS5)在乳腺癌中发展和上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中的影响。方法采用实时定量聚合酶链反应法检测乳腺癌组织和癌旁组织(n=36)、乳腺癌MCF-7亲本和耐药细胞中lncRNA-GAS5的表达,并分析GAS5表达与乳腺癌临床分期和淋巴结转移相关性;qRT-PCR法、Western blot和免疫组化法检测细胞周期和EMT相关蛋白的表达;迁移、趋化和黏附分离实验检测细胞生物学活性;通过光学显微镜观察细胞的形态学变化;以耐药细胞株构建裸鼠乳腺癌模型,体内探讨过表达GAS5对紫杉醇抗乳腺癌作用的影响。结果 LncRNA GAS5转录本水平相对于癌旁组织是显著降低的(P<0.05),GAS5低表达与乳腺癌TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05);耐药细胞株中GAS5表达下调(P<0.05),GAS5与P21表达正相关,而与CDK6表达呈负相关;体外干扰GAS5促进乳腺癌亲本细胞株发生EMT表型改变和侵袭能力增加,而过表达lncRNA GAS5可抑制乳腺癌耐药细胞株EMT表型和侵袭能力(P<0.05),并提高紫杉醇的药物敏感性。体内实验发现,过表达GAS5通过逆转EMT标志蛋白,提高紫杉醇抑制肿瘤生长和肺转移的作用。结论 LncRNA GAS5低表达可能通过诱导EMT促进乳腺癌的肺转移,可能是乳腺癌的一个潜在治疗靶点。 展开更多

关键词 长链非编码RNA 生长停滞特异性转录本5 乳腺癌 上皮细胞-间充质转化

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脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白E基因多态性与2型糖尿病并发冠心病的关系 被引量：5

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作者 石玉荣 周海艳 章尧 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期85-88,共4页

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者脂肪酸结合蛋白(FABP2)及载脂蛋白E(ApoE)与冠心病(CHD)的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-PFLP)技术分别检测T2DM并发CHD组及T2DM非CHD组FABP2、ApoE基因型,并检测T2DM并发CHD组不同... 目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者脂肪酸结合蛋白(FABP2)及载脂蛋白E(ApoE)与冠心病(CHD)的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-PFLP)技术分别检测T2DM并发CHD组及T2DM非CHD组FABP2、ApoE基因型,并检测T2DM并发CHD组不同等位基因携带者血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HLD-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。结果T2DM并发CHD组FABP2A/T突变频率高于非冠心病组(P<0.05),T等位基因携带者与A等位基因携带者相比TG、TC、LDL-C浓度升高,血HDL-C浓度降低,有显著性差异(P<0.05);T2DM并CHD组ε4等位基因频率明显高于对照组(P<0.01),ε4等位基因携带者与ε3等位基因携带者相比TC、LDL-C浓度升高,HDL-C浓度降低,差异有统计学意义(P<0.05),FABP与ApoE基因连锁分析,FABP2T基因和ApoEε4基因连锁时,T2DM并发CHD的几率增加(P<0.05)。结论FABP2T基因及ApoE/ε4等位基因增高T2DM并发CHD的遗传易感性。 展开更多

关键词 糖尿病 冠心病 脂肪酸结合蛋白 基因多态性 载脂蛋白E

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LY294002靶向抑制PI3K/Akt信号通路干预K562细胞增殖的研究 被引量：9

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作者 耿英华 武文娟 +1 位作者 于北凯 夏瑞祥 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2014年第3期295-299,共5页

目的探讨PI3K/Akt抑制剂LY294002对慢性髓系白血病细胞株K562的增殖抑制作用及相关机制。方法 MTT法检测LY294002对K562细胞增殖的抑制作用;10、20μmol/L LY294002作用K562细胞36 h,流式细胞术观察细胞周期的变化,RT-PCR法测定LY294002... 目的探讨PI3K/Akt抑制剂LY294002对慢性髓系白血病细胞株K562的增殖抑制作用及相关机制。方法 MTT法检测LY294002对K562细胞增殖的抑制作用;10、20μmol/L LY294002作用K562细胞36 h,流式细胞术观察细胞周期的变化,RT-PCR法测定LY294002对K562细胞Skp2基因表达的影响,Western blot法检测Skp2蛋白表达的变化。结果 LY294002能够抑制K562细胞的生长,该抑制作用具有浓度及时间依赖性(P<0.05)。LY294002作用K562细胞36 h,随着浓度的增加,G0/G1期阻滞增强,S期细胞减少(P<0.05),Skp2的mRNA表达量减少,Skp2蛋白的表达量显著降低。结论 LY294002能够抑制K562细胞的生长,诱导细胞发生G0/G1期阻滞,这可能是通过LY294002影响了Skp2表达而实现的。 展开更多

关键词 LY294002 PI3K Akt SKP2 K562

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pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒的构建及其在活细胞内的作用 被引量：2

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作者 高艳军 杨清玲 +1 位作者 陈昌杰 丁勇兴 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期519-526,共8页

目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用。方法:应用化学合成法获得巨噬细胞... 目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用。方法:应用化学合成法获得巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viralmacrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21肽(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)编码的基因序列,克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VC155中,筛选含有目标基因的正确克隆。利用RT-PCR扩增人乳腺癌细胞株SKBR3的CXCR4全长基因后,T-A亚克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VN173载体中。然后,经酶切鉴定及DNA测序分析2个基因是否正确连接至真核表达载体中。应用脂质体转染的方法共转染pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VC155-CXCR4至细胞株COS-7中,在荧光显微镜下观察NT21MP与CXCR4在胞内的相互作用。结果:经DNA测序及同源性对比,证实pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VN173-CXCR4重组载体构建成功;基因片段与NCBI基因库vMIP-Ⅱ和CXCR4基因CDS序列同源性达99.9%。BiFC法观察NT21MP与CXCR4在细胞内结合出现的荧光信号,该信号分布细胞内。结论:本实验成功构建了应用BiFC技术的真核表达载体,并且在活细胞内检测到NT21MP与CXCR4的互相结合。 展开更多

关键词 受体 趋化因子/遗传学 趋化因子CXCL2 质粒 重组蛋白质类/遗传学 遗传载体 转染 遗传互补测验

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hucMSCs源性外泌体对单核巨噬细胞生长及炎性因子IL-8、IL-12分泌水平的影响 被引量：2

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作者 丁娟 徐正阳 +3 位作者 柴烁 王珏 张强 李玉云 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期19-22,28,共5页

目的初步探讨人脐带间充质干细胞(hucMSCs)来源的外泌体(exosome)对单核巨噬细胞生长及炎性因子IL-8、IL-12分泌的影响。方法将hucMSCs来源的exosome与单核巨噬细胞(THP-1细胞株)共培养,利用MTT法和Annexin V-FIFC/PI双染法检测共培养后... 目的初步探讨人脐带间充质干细胞(hucMSCs)来源的外泌体(exosome)对单核巨噬细胞生长及炎性因子IL-8、IL-12分泌的影响。方法将hucMSCs来源的exosome与单核巨噬细胞(THP-1细胞株)共培养,利用MTT法和Annexin V-FIFC/PI双染法检测共培养后THP-1细胞的增殖及凋亡情况;PCR法和ELISA法分别检测THP-1细胞炎性因子IL-8、IL-12的mRNA及蛋白的表达情况。结果 MTT及流式细胞术检测结果显示hucMSCs来源的exosome对THP-1细胞具有促进增殖和抑制凋亡的作用,PCR及ELISA方法结果显示,exosome能够降低THP-1细胞IL-8、IL-12 mRNA及蛋白的表达水平。结论 hucMSCs源性exosome能够影响单核巨噬细胞的生长,并降低炎性因子IL-8、IL-12的分泌水平,而这可能是微环境中间充质干细胞调控单核巨噬细胞的机制之一。 展开更多

关键词 炎症微环境 单核巨噬细胞 人脐带间充质干细胞 外泌体

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人源性抗乳腺癌HER2噬菌体单链抗体库的构建与筛选 被引量：1

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作者 卢晓辉 王志文 +4 位作者 蔡颖 黄静 朱丽华 杨清玲 陈昌杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期434-440,共7页

目的：构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体（scFv）库，筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）特异性scFv，为HER2和CXC趋化因子受体4（CXCR4）双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列。方法：取已确诊的乳腺癌患者... 目的：构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体（scFv）库，筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）特异性scFv，为HER2和CXC趋化因子受体4（CXCR4）双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列。方法：取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织，提取总RNA；构建可变区基因的T载体库，将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与pCANTAB连接肽连接，获得pCANTAB-scFv，电转化感受态大肠杆菌TG1；以M13K07辅助噬菌体进行感染，获噬菌体抗体库；利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测筛选后获得的噬菌体抗体活性，以免疫组织化学法检测抗体亲和力，并通过测序进一步鉴定。结果：成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库，获得的scFv长度为750bp，VH和VL长度分别为375和330kb；电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确，得到库容为2．48×10^8的大容量抗体库；通过噬菌体展示和淘洗筛选，富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库；所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性，对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力；测序结果与人IgG抗体进行对比，所获得的scFv具有高度的人源性。结论：主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库，并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv，为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤/免疫学 DNA 互补/遗传学 基因文库 抗体 细菌/遗传 学 细菌噬菌体/遗传学 受体 erbB-2 受体 CXCR4 聚合酶链反应

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病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ-N端肽联合三氧化二砷对乳腺癌生长和转移的抑制作用 被引量：1

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作者 陈素莲 郭玉红 +4 位作者 童芳 李自岩 张枫 杨清玲 陈昌杰 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期268-272,共5页

目的利用荷乳腺癌动物模型观察病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ-N端肽(NT21MP)联合三氧化二砷(As2O3)对乳腺癌生长和肺转移的抑制效应,为选择最佳的乳腺癌治疗方案提供依据。方法建立荷乳腺癌BALB/c小鼠模型,测量荷瘤小鼠的肿瘤大小,计算抑瘤率... 目的利用荷乳腺癌动物模型观察病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ-N端肽(NT21MP)联合三氧化二砷(As2O3)对乳腺癌生长和肺转移的抑制效应,为选择最佳的乳腺癌治疗方案提供依据。方法建立荷乳腺癌BALB/c小鼠模型,测量荷瘤小鼠的肿瘤大小,计算抑瘤率;苏木精-伊红(HE)染色观察肿瘤病理组织学变化和肺转移情况;苦味酸浸泡法计数肺结节;利用TUNEL法及免疫组化SP法检测各组原发肿瘤组织中细胞凋亡指数(AI)以及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果 NT21MP和As2O3均可抑制原发瘤的生长,抑制率分别为30.4%和40.0%,联合用药效果更显著(54.4%)。NT21MP和As2O3均可抑制肺转移,以两者联合用药作用更明显。与生理盐水对照组相比,NT21MP组、As2O3组及NT21MP+As2O3组增殖细胞核抗原指数明显降低(均P<0.05),凋亡指数明显升高(均P<0.05),以联合用药作用更明显(P<0.05)。结论 NT21MP和As2O3可通过抑制增殖、促进凋亡而抑制肿瘤的生长和转移,并具有协同效应。 展开更多

关键词 乳腺癌 巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ N端肽 三氧化二砷

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靶向P75的siRNA对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

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作者 陈素莲 马佳 +4 位作者 张枫 余新超 李翠云 杨清玲 陈昌杰 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1124-1128,共5页

目的构建P75特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对神经生长因子(NGF)促乳腺癌细胞生长及凋亡的影响。方法通过GenBank提供的P75mRNA序列,设计3对能转录短发夹状RNA的DNA序列,构建pSilencerTM4.1-CMV neo质粒重组载体,转染乳腺癌SKBR... 目的构建P75特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对神经生长因子(NGF)促乳腺癌细胞生长及凋亡的影响。方法通过GenBank提供的P75mRNA序列,设计3对能转录短发夹状RNA的DNA序列,构建pSilencerTM4.1-CMV neo质粒重组载体,转染乳腺癌SKBR3细胞;通过实时荧光定量PCR和Western blot筛选RNA干扰效果最强的干扰片段;以此干扰片段转染至乳腺癌SKBR3细胞,利用G418筛选稳定表达P75-siRNA的SKBR3细胞株,命名为P75-siRNA;MTT检测P75干扰后NGF对细胞增殖作用的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;建立荷乳腺癌小鼠模型,观察P75干扰后对小鼠肿瘤生长和凋亡相关蛋白表达的影响。结果序列测定表明成功构建P75-siRNA表达载体,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示P75mRNA和蛋白表达下调,尤以P752-siRNA干扰片段效果显著;MTT检测显示,NGF能刺激细胞增殖,与NGF组相比,P75-siRNA干扰后细胞增殖率均明显增高(P<0.05);与空白对照组相比,NGF+P75-siRNA组和NGF组的细胞凋亡率明显降低(P<0.05),NGF+P75-siRNA组更为明显;荷乳腺瘤小鼠中,P75-siRNA组小鼠的肿瘤生长明显超过未转染组和空载体转染组(P<0.05),且P75-siRNA组Caspase-3表达下降,Bcl-2表达增加,Bax表达下降(P<0.05)。结论P75特异干扰表达载体能有效降低P75的表达,增强NGF促乳腺癌SKBR3细胞的增殖作用和抗凋亡作用,从而使肿瘤生长更为明显。 展开更多

关键词 乳腺癌 P75 SIRNA

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