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弓形虫表面抗原SAG3基因和IL-2基因佐剂混合诱导小鼠免疫应答研究 被引量：18
1
作者 周永安 余新炳 +4 位作者 陈海峰 郑焕钦 殷国荣 吴忠道 陈观今 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第11期945-948,共4页
目的了解编码SAG3的重组质粒和IL-2基因佐剂在小鼠体内的免疫反应,为进一步的核酸疫苗及免疫学研究创造条件。方法将编码SAG3的质粒和鼠源性IL-2表达载体以100μg的剂量感染小鼠,3周中两次以相同的剂量加强免疫,分别以PBS和空质粒pcDNA... 目的了解编码SAG3的重组质粒和IL-2基因佐剂在小鼠体内的免疫反应,为进一步的核酸疫苗及免疫学研究创造条件。方法将编码SAG3的质粒和鼠源性IL-2表达载体以100μg的剂量感染小鼠,3周中两次以相同的剂量加强免疫,分别以PBS和空质粒pcDNA3.1感染。采用ELISA法测定抗体水平、亚型、IFN-γI、L-4和IL-2的含量,RT-PCR方法检测注射部位目的基因的转录,所有鼠均由强毒力ZS2株弓形虫感染。结果SAG3表达质粒3次免疫后鼠体内特异IgG水平明显上升,IL-2表达质粒的联合使用导致IgG2a水平的升高和IFN-γ的产生,提高了其分泌IL-2的水平,但对IL-4的水平产生轻微的影响;RT-PCR显示首次使用导致IgG2a水平的升高和IFN-γ的产生,提高了其分泌IL-2的水平,但对IL-4的水平产生轻微的影响;RT-PCR显示首次免疫15天后,目的基因在肌肉组织中仍有表达;混合质粒注射和小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长。结论由SAG3 DNA诱导的免疫应答因IL-2表达质粒的共同注射而增强,DNA疫苗和适当细胞因子的共注射对抵抗弓形虫感染的效果值得进一步研究。 展开更多
关键词 DNA免疫 弓形虫表面抗原SAG3 基因佐剂 免疫应答
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华支睾吸虫翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的鉴定及其编码区序列克隆 被引量：6
2
作者 何东苟 余新炳 +4 位作者 吴忠道 徐劲 吴德 胡旭初 陈守义 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第2期117-121,共5页
目的　通过cDNA文库筛选识别华支睾吸虫新基因 ,并将所发现的华支睾吸虫翻译控制肿瘤蛋白 (csTCTP)编码区克隆到原核表达质粒PGEX - 4T - 1和真核表达质粒 pcDNA3上 ,为进一步研究其功能奠定基础。 方法　将插入于 pBlue script质粒上的... 目的　通过cDNA文库筛选识别华支睾吸虫新基因 ,并将所发现的华支睾吸虫翻译控制肿瘤蛋白 (csTCTP)编码区克隆到原核表达质粒PGEX - 4T - 1和真核表达质粒 pcDNA3上 ,为进一步研究其功能奠定基础。 方法　将插入于 pBlue script质粒上的cDNA进行随机测序 ,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析 ,识别华支睾吸虫新基因 ,并应用Motifsan、Scan prosite等程序对其进行结构域分析。根据PGEX - 4T - 1和pcDNA3上的克隆位点及所发现的csTCTPcDNA编码序列设计引物 ,进行PCR扩增 ,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX4T - 1和真核表达载体 pcDNA3上。构建的PGEX4T- 1-csTCTP、pcDNA3-csTCTP重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。 结果　发现华支睾吸虫新基因———csTCTP ,完整阅读框含 5 10个碱基 ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 4 5 96Kd。序列分析表明 ,csTCTP编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性 ,Motifscan及Scanprosite程序发现推导的氨基酸序列具有TCTP保守的完整功能域以及两个典型的TCTP完整标签。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。结论　发现华支睾吸虫翻译控制肿瘤蛋白基因 ,并成功构建原核和真核重组表达质粒。 展开更多
关键词 华支睾吸虫 翻译控制肿瘤蛋白 TCTP 基因 鉴定 编码区序列克隆
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弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的构建及筛选 被引量：6
3
作者 韦相才 钟兴明 +2 位作者 郑焕钦 陈观今 王景圆 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第12期1045-1048,1061,共5页
目的　构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体 ,建立基因敲除突变株 ,为进一步探讨SAG3功能和弓形虫侵入宿主细胞机制提供可行的研究方法。方法　用基因克隆方法将SAG31.5 3kb和 2 .81kb两个同源序列分别插入TUB5 /CAT质粒中 ,构建置换型打... 目的　构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体 ,建立基因敲除突变株 ,为进一步探讨SAG3功能和弓形虫侵入宿主细胞机制提供可行的研究方法。方法　用基因克隆方法将SAG31.5 3kb和 2 .81kb两个同源序列分别插入TUB5 /CAT质粒中 ,构建置换型打靶载体 ,氯霉素乙酰转移酶 (CAT)抗性基因作为筛选标记 ,采用电转移转染细胞方法进行基因打靶 ,建立突变型的弓形虫株 ,采用PCR、酶切分析和SouthernBlot杂交方法筛选鉴定。结果　构建了弓形虫RH株 5’SAG3 TUB5 /CAT 3’SAG3置换型载体 ,获得了敲除SAG3基因的弓形虫突变株 ,建立基因敲除突变株 ,获得了阳性的筛选克隆 ,经鉴定证明基因打靶结果准确。结论　通过构建基因打靶载体 ,可有目的地敲除弓形虫膜抗原基因 ,为进一步研究弓形虫侵入机制 ,探讨弓形虫病防治提供可行的方法。 展开更多
关键词 弓形虫 膜抗原 SAG3 基因打靶 载体
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广州管圆线虫成虫cDNA文库构建 被引量：7
4
作者 梁瑜 王轶 +5 位作者 何蔼 李道宁 俞慕华 李卓雅 张瑞琳 詹希美 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第2期34-37,共4页
目的　构建广州管圆线虫成虫cDNA文库。方法　提取广州管圆线虫成虫总RNA ,用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA ,然后通过长距离PCR方法合成双链cDNA并扩增 ;PCR产物与λTripIE× 2载体连接并包装 ,建成... 目的　构建广州管圆线虫成虫cDNA文库。方法　提取广州管圆线虫成虫总RNA ,用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA ,然后通过长距离PCR方法合成双链cDNA并扩增 ;PCR产物与λTripIE× 2载体连接并包装 ,建成未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库扩增及测定扩增文库的滴度。结果　经测定 ,未扩增文库滴度为 9 7× 1 0 6 pfu/ml,重组效率达 99 2 %以上 ,文库扩增后滴度达 9 1 3× 1 0 9pfu/ml。 展开更多
关键词 广州管圆线虫 成虫 CDNA文库 构建 广州管圆线虫病
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日本血吸虫肺期童虫收集方法的实验研究 被引量：2
5
作者 孟玮 吴忠道 +3 位作者 余新炳 彭寨玉 阮志燕 袁竹青 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第2期173-175,共3页
目的建立一种收集纯净肺期童虫的方法。方法用日本血吸虫尾蚴感染昆明小鼠,分别于感染后第1、2、3、4、5、6、7、10、12、14、21天解剖,从皮肤、肺脏、肠系膜静脉及肝门静脉处收集童虫。结果肺期童虫出现的高峰期为感染后第3天,获得最... 目的建立一种收集纯净肺期童虫的方法。方法用日本血吸虫尾蚴感染昆明小鼠,分别于感染后第1、2、3、4、5、6、7、10、12、14、21天解剖,从皮肤、肺脏、肠系膜静脉及肝门静脉处收集童虫。结果肺期童虫出现的高峰期为感染后第3天,获得最佳收获肺期童虫的时间,建立了回收大量纯净童虫的方法。 展开更多
关键词 日本血吸虫 肺期 血吸虫童虫
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华支睾吸虫乙醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析 被引量：1
6
作者 吴德 吴忠道 +2 位作者 徐进 何东苟 余新炳 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期241-244,249,共5页
【目的】通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库,发现并识别新基因,将发现的新基因编码区克隆到原核表达质粒pGEX鄄4T鄄1并表达出融合蛋白。【方法】用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增,对产物为500bp以上的质粒测序,结果... 【目的】通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库,发现并识别新基因,将发现的新基因编码区克隆到原核表达质粒pGEX鄄4T鄄1并表达出融合蛋白。【方法】用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增,对产物为500bp以上的质粒测序,结果在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析,并应用ORFfind、ClustalW、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行开放阅读框(ORF)、进化树及结构域分析。根据载体多克隆位点及新基因ORF设计引物,PCR扩增,产物克隆到目的载体上。筛选并鉴定出阳性克隆,对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS鄄PAGE电泳鉴定。【结果】发现CsALDH基因,完整阅读框含1467个碱基,编码489个氨基酸,理论相对分子质量Mr≈52.564×103,理论pI为5.43。序列分析表明,CsALDH基因编码的氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,CsALDH与爪蛙属乙醛脱氢酶的同源性为59%,具有乙醛脱氢酶保守功能域。构建的重组原核表达质粒经鉴定与目标基因相符。电泳显示表达产物在Mr≈78×103处有一条特异性条带。【结论】发现华支睾吸虫磷酸甘油醛脱氢酶基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。 展开更多
关键词 华支睾吸虫 乙醛脱氨酶 分子克隆 原核表达 序列分析
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恶性疟原虫海南株端粒酶催化亚基基因的克隆及序列分析 被引量：1
7
作者 陈守义 徐劲 +3 位作者 李军涛 武忠銮 胡旭初 余新炳 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第5期36-37,共2页
目的　克隆恶性疟原虫端粒酶基因 ,为今后筛选抗疟药物提供理论依据。方法　根据四膜虫的端粒酶基因序列 ,设计并合成一对引物 ,从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出端粒酶基因 ,进行测序及利用生物信息学技术对端粒酶基因进行了分析。结果... 目的　克隆恶性疟原虫端粒酶基因 ,为今后筛选抗疟药物提供理论依据。方法　根据四膜虫的端粒酶基因序列 ,设计并合成一对引物 ,从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出端粒酶基因 ,进行测序及利用生物信息学技术对端粒酶基因进行了分析。结果　得到了 2 3kp的恶性疟原虫海南株端粒酶基因。结论　恶性疟原虫端粒酶基因的克隆 。 展开更多
关键词 恶性疟原虫 海南株 端粒酶 亚基基因 基因克隆 序列分析 基因序列
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肺炎链球菌R6株全基因组序列的初步分析 被引量：2
8
作者 袁竹青 吴忠道 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第6期93-94,97,共3页
关键词 肺炎链球菌 全基因组序列 生物学 基因组特征 跨膜透酶 转运蛋白
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抗华支睾吸虫循环抗原Fab抗体克隆的筛选及序列分析
9
作者 俞慕华 何蔼 +4 位作者 黄文繁 孟锦绣 雷智刚 李卓雅 詹希美 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2002年第4期5-7,共3页
目的　获得抗华支睾吸虫循环抗原Fab段抗体。方法　将华支睾吸虫代谢抗原包被在固相ELISA板中 ,采用“吸附 -洗脱 -扩增”的方法 ,对已构建的抗华支睾吸虫噬菌体抗体库进行富集。从富集后的抗体库中筛选抗循环抗原抗体克隆 ,并交叉筛选... 目的　获得抗华支睾吸虫循环抗原Fab段抗体。方法　将华支睾吸虫代谢抗原包被在固相ELISA板中 ,采用“吸附 -洗脱 -扩增”的方法 ,对已构建的抗华支睾吸虫噬菌体抗体库进行富集。从富集后的抗体库中筛选抗循环抗原抗体克隆 ,并交叉筛选鉴定其特异性。结果　从 2 0 6个克隆中筛选到阳性克隆 2 3个 ,再分别用肺吸虫、肝片虫、姜片虫和日本血吸虫脱脂全虫粗抗原进一步交叉筛选 ,最终获得特异性抗Cs -MAg阳性克隆 3个 (B0 5 ,C10和E38)。对其中 2株 (E38和B0 5 )序列分析表明它们的κ轻链V基因属于人VκⅠ (O2 )亚群 ,J基因属于Jκ1;γ链V基因属于人VHⅠ - 6 9亚群 ,D基因来自D3- 10 ,J基因则来自JH3。结论　用成虫代谢抗原直接包板 ,可以从抗体库中筛选到阳性克隆 。 展开更多
关键词 华支睾吸虫 FAB抗体 克隆 筛选 序列分析 噬菌体 可变区基因 循环抗原
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