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登革2型病毒重组E蛋白的生物学特性分析 被引量:2
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作者 魏惠永 江丽芳 +2 位作者 曾祥凤 方丹云 郭辉玉 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期214-216,220,共4页
[目的]检测重组 D2V全长 E蛋白纯化后的免疫反应性与抗原性,为其亚单位疫苗研制奠定基础.[方法]酵母表达上清超滤浓缩后用金属螯合亲和层析(MCAC)法过柱,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术观察蛋白条带.将纯化蛋白与... [目的]检测重组 D2V全长 E蛋白纯化后的免疫反应性与抗原性,为其亚单位疫苗研制奠定基础.[方法]酵母表达上清超滤浓缩后用金属螯合亲和层析(MCAC)法过柱,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术观察蛋白条带.将纯化蛋白与组氨酸抗体、 D2V E单抗进行斑点印迹和蛋白印迹,以确定纯化物是否为含组氨酸尾的 D2V E融合蛋白,并用 ELISA检测纯化 E蛋白与不同 DV抗体的结合反应.用纯化的重组 D2V E蛋白免疫小鼠后测定其产生的抗体类型与滴度,以分析其抗原性.[结果]表达产物经 MCAC柱纯化获得单一的相对分子质量为 69× 103的蛋白,组氨酸抗体与 D2V E单抗的印迹试验证实该条带就是含多聚组氨酸尾型特异的重组 E蛋白(rEgp) , ELISA显示纯化的 rEgp保留有免疫反应性及型特异性,内糖苷酶 H消化证实其含有 N联高甘露糖残基.接种 rEgp可诱生针对 D2V抗原与重组 E蛋白的高效抗体.[结论]纯化的 D2V全长 E蛋白保留其免疫原性和免疫反应性,并具有型特异性. 展开更多
关键词 登革热病毒 膜糖蛋白类 重组蛋白质 分离 纯化 抗体 层析法
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日本血吸虫SCP/TAPS基因家族的生物信息学分析和克隆表达
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作者 陈静芳 胡旭初 +1 位作者 王乐旬 余新炳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期804-807,811,共5页
目的以黄蜂Vv Vesv5蛋白为检索源检索日本血吸虫EST数据库,对检索出的序列进行生物信息学分析,并挑选出有代表性的基因进行克隆表达,为日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白的功能研究打下一定的基础。方法利用生物信息学软件对检索出的日本血吸... 目的以黄蜂Vv Vesv5蛋白为检索源检索日本血吸虫EST数据库,对检索出的序列进行生物信息学分析,并挑选出有代表性的基因进行克隆表达,为日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白的功能研究打下一定的基础。方法利用生物信息学软件对检索出的日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白进行生物信息学分析,经PCR确定后,以AAW24579为代表进行进一步的研究,将其命名为SjVAL2。根据SjVAL2的序列设计引物,通过RT-PCR扩增出全长编码区域,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠埃希菌中诱导表达并纯化,免疫印迹实验(Western-blotting)鉴定纯化的重组蛋白。结果日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,多序列比对分析发现它们初步可以分为3个不同的亚组。以日本血吸虫成虫cDNA为模板RT-PCR扩增出SjVAL2序列,PCR、双酶切及DNA测序均证实pET-28a(+)-SjVAL2重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌中获得高效表达,重组蛋白能识别日本血吸虫感染的小鼠血清,说明其具有免疫反应性。结论日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,其中SjVAL2基因可在原核表达系统中高效表达,为进一步研究该家族蛋白的功能打下基础。 展开更多
关键词 日本血吸虫 SCP/TAPS基因家族 基因克隆 原核表达
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H7N9禽流感病毒对人类致病的分子基础分析 被引量:24
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作者 于玉凤 郭晓兰 +5 位作者 王颖 周俊梅 方丹云 曾谷城 晏辉钧 江丽芳 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期657-665,共9页
【目的】了解H7N9禽流感病毒对人类致病的分子特征,为更好地预防与治疗H7N9人禽流感提供科学依据。【方法】从GISAID数据库中下载中国2013年分离的所有H7N9禽流感病毒株的基因及蛋白序列,并从NCBI数据库中下载其他相关的流感病毒序列,... 【目的】了解H7N9禽流感病毒对人类致病的分子特征,为更好地预防与治疗H7N9人禽流感提供科学依据。【方法】从GISAID数据库中下载中国2013年分离的所有H7N9禽流感病毒株的基因及蛋白序列,并从NCBI数据库中下载其他相关的流感病毒序列,运用生物信息学软件分析H7N9禽流感病毒基因的系统进化特征、受体结合位点、宿主特异位点、飞沫传播关键氨基酸位点、致病及毒力相关位点、耐药性位点及潜在糖基化位点等的变异情况。【结果】2013年中国流行的H7N9禽流感病毒为四源重组病毒,所有基因片段均来源于禽类,不含任何人流感病毒基因;病毒HA的受体结合位点发生了2个关键氨基酸的变异(G186V和Q226L);在与飞沫传播有关的关键氨基酸位点中,个别氨基酸已发生了变异(T160A、Q226L);该病毒具有8个毒力增强位点;所有分离株的M2均发生了S31N变异;分离株A/Shanghai/1/2013的NA的耐药位点发生了R294K变异;所有毒株的潜在糖基化位点均相对保守。【结论】H7N9禽流感病毒为四源重组的新型禽流感病毒。该病毒具有与人呼吸道上皮细胞SAa-2,6 Gal受体结合的分子基础,但目前尚未获得经飞沫传播的充分条件,人传人的可能性不大。该病毒具有低致病性禽流感病毒的分子特征,表明对禽类致病性不强,但其对人类呈高致病性,这可能与其毒力位点的特征有关。所有分离毒株均发生了对离子通道抑制剂金刚烷胺类药物的耐药性突变,个别毒株已发生了对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(达菲)的耐药性突变。 展开更多
关键词 H7N9禽流感病毒 致病性 分子基础 生物信息学
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两株人H7N9禽流感病毒的全基因组测序及分子特征分析 被引量:15
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作者 郭晓兰 司露露 +5 位作者 管大伟 王颖 于玉凤 方丹云 武婕 江丽芳 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期167-175,共9页
【目的】对两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的人H7N9禽流感病毒进行全基因组测序,研究其来源、基因组特征以及相互间的分子差异,旨在了解毒株的遗传进化特征与其致病性及其所致疾病临床类型的关系,为进一步阐明H7N9禽流感病毒的致... 【目的】对两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的人H7N9禽流感病毒进行全基因组测序,研究其来源、基因组特征以及相互间的分子差异,旨在了解毒株的遗传进化特征与其致病性及其所致疾病临床类型的关系,为进一步阐明H7N9禽流感病毒的致病机制提供科学依据。【方法】选取两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的H7N9禽流感病毒进行全基因组序列测定;运用生物信息学软件比较分析两株病毒的遗传进化关系、基因组特征、受体结合位点、宿主特异性位点及致病相关位点等重要分子特征;从禽流感共享数据(GISAID)下载2013年至2014年10月轻症和重症病例的病毒分离株序列,分析致病相关关键位点差异,并分析这些变异与其致病性及所致疾病临床类型的关系。【结果】这两株H7N9禽流感病毒的HA、NA和M基因来源于2013年华东地区流行的H7N9禽流感病毒,NP、NS、PA、PB1和PB2基因来源于2013年在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒;H7N9禽流感病毒PA蛋白L336M和PB1蛋白I368V的突变率随流行时间的延长而逐渐上升,并存在地区差异;两株病毒各基因核苷酸同源性达到99.2%以上,氨基酸同源性在99.5%以上,但各基因节段存在个别氨基酸的差异,其中HA受体结合位点存在一个关键氨基酸的差异(226L和226 Q),宿主特异性位点存在两个关键氨基酸的差异(PB2-591L和PB2-591Q,PB2-627E和PB2-627K),毒力位点存在两个关键氨基酸差异(PA-353R和PA-353K,PB2-627E和PB2-627K);M2均发生了S31N突变;潜在糖基化位点均相对保守;2013年至2014年10月报道的重症病例病毒分离株PB2蛋白E627K突变率高于轻症病例分离株。【结论】两株来自不同临床类型的H7N9禽流感病毒是一种新的重组病毒,是由华东地区流行的人H7N9禽流感病毒和在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒基因重组而来;H7N9禽流感病毒的某些致病相关的关键氨基酸位点在流行的过程中不断发生变异,必须密切监测毒株的变异动向;两株致病力不同的病毒各基因节段虽然同源性较高,但存在关键氨基酸位点的差异,其中PB2蛋白627位氨基酸位点的差异可能对病毒的致病性起重要作用,与所致疾病临床类型相关。 展开更多
关键词 H7N9禽流感病毒 测序 进化特征 分子特征 致病性 临床类型
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广东省2009-2012年呼吸道合胞病毒的流行病学特征 被引量:15
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作者 张定梅 朱勋 +5 位作者 姚婷婷 徐霖 吴珏珩 何振健 郑芸 曹开源 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期292-298,共7页
【目的】对急性呼吸道感染症状病人中呼吸道合胞病毒(RSV)流行情况进行监测,分析RSV在广东地区的流行特征,为今后广东地区RSV的监控和防治提供参考资料。【方法】2009年7月至2012年6月期间在广东省25家哨点医院采集急性呼吸道感染病例... 【目的】对急性呼吸道感染症状病人中呼吸道合胞病毒(RSV)流行情况进行监测,分析RSV在广东地区的流行特征,为今后广东地区RSV的监控和防治提供参考资料。【方法】2009年7月至2012年6月期间在广东省25家哨点医院采集急性呼吸道感染病例咽拭子标本,提取标本RNA,反转录成cDNA,利用巢式PCR进行RSV检测;对RSV阳性标本进行其他6种呼吸道病毒的检测,了解混合感染情况。检测结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析,用Excel作图表,对病人人口学特征、不同病例类型、不同性别、不同年龄组和时间的检出情况进行统计描述,率的比较用卡方检验,α取0.05。【结果】共收集了14 227份咽拭子标本,7 318份来自门诊病例,6 909份来自住院病例;男性8 485人,女性5 742人;病人年龄从0岁到110岁。RSV阳性标本1 113份,检出率为7.82%。住院病例检出率明显高于门诊病人检出率(P<0.001),男性病例检出率明显高于女性病例(P<0.001),儿童检出率高于成人(P<0.001),阳性病例中2岁以下儿童所占比例为77.72%;1-4月份RSV检出率较高(P<0.001)。245例发生了混合感染,215例为双重感染,29例为三重感染,1例为四重感染。混合感染中男性病例较多,占69.39%(170/245);住院病例比例较大,占74.70%(183/245);小于3岁的儿童和20~35岁青年人较多,分别为75.51%(185/245)、11.43%(28/245)。混合感染多发生在1~4月。【结论】广东地区RSV的主要感染人群是2岁以下儿童,要加强对0~2岁儿童的防护,特别是男性病例和住院病例;预防工作要全年进行,重点在1~4月,预防因RSV感染导致的住院率和混合感染率增高。 展开更多
关键词 急性呼吸道感染 传染病 呼吸道合胞病毒 混合感染 流行病学
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亚胺培南耐药铜绿假单胞菌的金属β-内酰胺酶检测 被引量:23
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作者 余广超 徐霖 +7 位作者 袁广卿 张甜 陈康 蒋岗 姜余琴 许沙沙 常彦敏 曹开源 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期223-227,共5页
目的了解金属β-内酰胺酶在广州地区铜绿假单胞菌中的流行状况及其流行亚型,完善广州地区金属β-内酰胺酶的分子流行病学资料。方法采用双纸片协同法和双纸片增效法对164株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌筛选金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株... 目的了解金属β-内酰胺酶在广州地区铜绿假单胞菌中的流行状况及其流行亚型,完善广州地区金属β-内酰胺酶的分子流行病学资料。方法采用双纸片协同法和双纸片增效法对164株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌筛选金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株,采用PCR检测5类金属β-内酰胺酶的编码基因(IMP家族、VIM家族、GIM-1、SPM-1和SIM-1),利用生物信息学的方法对检测到的金属β-内酰胺酶亚型进行比对分析并制作分子进化树。结果 164株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌中筛选出22株金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株,IMP阳性15株(9.1%),其中11株为IMP-9亚型,另外4株携带一个新的亚型,命名为IMP-25,VIM阳性5株(3.0%),均为VIM-2亚型,未检测到GIM-1、SPM-1和SIM-1型金属β-内酰胺酶。结论广州地区铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶的基因型已经出现多型化的特征,同时存在IMP型和VIM型金属β-内酰胺酶的流行,本次研究发现了一个新的金属β-内酰胺酶亚型(IMP-25),为IMP家族金属β-内酰胺酶的多样性及其分子流行病学资料提供了新的信息。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 金属Β-内酰胺酶 耐药基因
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活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析 被引量:11
7
作者 张建波 方毅敏 +5 位作者 黄艳 江丽芳 董涛 朱晓敏 方丹云 赖小敏 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1136-1139,1143,共5页
目的:建立多重PCR方法扩增α/βTCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/βTCR基因重排特点及CDR3谱型。方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和βTCR扩增引物... 目的:建立多重PCR方法扩增α/βTCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/βTCR基因重排特点及CDR3谱型。方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和βTCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列。结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列。α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主。同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列。结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法。结核患者病变局部克隆性增殖的TCRα和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性。 展开更多
关键词 活动性肺结核 T细胞受体 基因重排 CDR3 多重PCR
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某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因分析 被引量:11
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作者 周仕丹 刘春来 +6 位作者 杨润时 贾玲 李妍 曹海燕 晏辉钧 孙坚 庄志辉 《中国感染控制杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期495-504,共10页
目的研究某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)在细菌耐药方面的分子流行病学特征,为CRE的防控提供依据。方法收集某院2013-2017年细菌室保存的CRE,对其进行多位点序列分型(MLST)、药敏试验、全基因序列测定,选取部分CRE中携带的碳青霉烯... 目的研究某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)在细菌耐药方面的分子流行病学特征,为CRE的防控提供依据。方法收集某院2013-2017年细菌室保存的CRE,对其进行多位点序列分型(MLST)、药敏试验、全基因序列测定,选取部分CRE中携带的碳青霉烯耐药基因进行基因环境分析。结果共收集62株CRE,成功复活51株;其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)30株,耐碳青霉烯类大肠埃希菌(CREC)9株,耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌(CRECL)6株,耐碳青霉烯类其他肠杆菌6株。CRKP MLST主要包括3株ST147、2株ST11;CREC MLST主要包括3株ST167;CRECL MLST主要包括3株ST93、2株ST88。51株CRE对氨苄西林、头孢噻肟的耐药率最高,均为100%。耐碳青霉烯类耐药基因分布:1株携带blaKPC-2,14株携带blaIMP-4,18株携带blaNDM-1,22株携带blaNDM-5,2株携带blaNDM-9,10株携带blaOXA-1,10株携带blaOXA-10,2株携带blaOXA-23,2株携带blaOXA-66。分析blaNDM-1、blaNDM-5、blaNDM-9、blaIMP-4不同菌种的基因环境,发现几种耐药基因各自的基因环境都与已报道的基因环境相似,无明显的菌种间差异性。结论耐药基因通过水平传播能稳定存在于不同的CRE菌株中,对医院感染防控造成一定的威胁。 展开更多
关键词 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌 Β-内酰胺酶 多位点序列分型 基因环境 医院感染
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SARS患者血清IL-8、IL-12和TGF-β1的检测及意义 被引量:6
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作者 江振友 高阳 +3 位作者 方丹云 周经姣 晏辉钧 江丽芳 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第10期717-719,共3页
目的 :探讨SARS患者血清IL 8、IL 12和TGF β1在SARS冠状病毒感染致病中的作用。 方法 :应用酶联免疫吸附法 (ELISA)测定广州地区 2 8例SARS冠状病毒感染患者双份血清IL 8、IL 12和TGF β1的水平。实验数据采用两样本均数t检验法。结果 ... 目的 :探讨SARS患者血清IL 8、IL 12和TGF β1在SARS冠状病毒感染致病中的作用。 方法 :应用酶联免疫吸附法 (ELISA)测定广州地区 2 8例SARS冠状病毒感染患者双份血清IL 8、IL 12和TGF β1的水平。实验数据采用两样本均数t检验法。结果 :2 8例SARS冠状病毒感染者血清IL 8水平、病程第 2周IL 12水平比正常健康对照组明显降低 (P <0 0 5 )。SARS冠状病毒感染者血清TGF β1水平与对照组比较无明显差异 (P >0 0 5 )。 结论 :IL 8和IL 展开更多
关键词 IL-12 血清IL-8 TGF-Β1 SARS冠状病毒 SARS患者 对照组 致病 冠状病毒感染 免疫过程 广州地区
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登革病毒NS1蛋白的原核表达及其在登革热快速诊断中的应用 被引量:9
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作者 傅强 田疆 +4 位作者 方丹云 周俊梅 庞贤武 李兴华 江丽芳 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期316-321,共6页
【目的】重组表达1型登革病毒(DENV-1)和3型登革病毒(DENV-3)NS1蛋白,制备多克隆抗体,建立特异、敏感的登革病毒NS1抗原ELISA检测法。【方法】RT-PCR扩增DENV-1和DENV-3 NS1全长基因,经T-A克隆后,将目的基因分别与质粒PET30a(+)连接构... 【目的】重组表达1型登革病毒(DENV-1)和3型登革病毒(DENV-3)NS1蛋白,制备多克隆抗体,建立特异、敏感的登革病毒NS1抗原ELISA检测法。【方法】RT-PCR扩增DENV-1和DENV-3 NS1全长基因,经T-A克隆后,将目的基因分别与质粒PET30a(+)连接构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。阳性克隆经IPTG诱导表达,并对目的蛋白进行纯化。用纯化的NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗NS1多克隆抗体。应用NS1多克隆抗体建立登革病毒NS1抗原双抗体夹心ELISA检测法。【结果】成功构建了高效表达DENV-1和DENV-3 NS1蛋白的原核表达系统,获得纯化的NS1蛋白;用重组NS1蛋白免疫BALB/c小鼠后获得高效价(>1:30 000)的抗DENV-1和DENV-3 NS1的特异性抗体;用NS1多克隆抗体建立了登革病毒NS1抗原双抗体夹心ELISA检测法,该法可特异性检出登革病毒NS1抗原,敏感性达到1 ng/mL,与黄病毒的其它成员无交叉反应,表明具有良好的特异性。【结论】本研究成功构建了DENV-1和DENV-3 NS1蛋白的原核表达系统,高效表达了具有良好免疫原性及免疫反应性的DENV-1和DENV-3重组NS1蛋白;建立了检测登革病毒NS1抗原的双抗体夹心法,并证明该检测法具有较高的灵敏度和特异性,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 登革病毒 NS1蛋白 原核表达 多克隆抗体
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脂多糖诱导血管内皮细胞凝血途径相关因子基因表达变化 被引量:4
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作者 唐小龙 蔡淑玉 +2 位作者 江振友 王华东 江丽芳 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期1540-1544,共5页
目的:观察脂多糖(LPS)对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织因子(TF)、组织因子抑制物(TFPI)和凝血酶调节蛋白(TM)的影响。方法:应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养,用生长良好的第2、3代细胞进行实验。同时应用CCK-8测定细胞在不同浓度... 目的:观察脂多糖(LPS)对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织因子(TF)、组织因子抑制物(TFPI)和凝血酶调节蛋白(TM)的影响。方法:应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养,用生长良好的第2、3代细胞进行实验。同时应用CCK-8测定细胞在不同浓度的LPS(1-100 mg/L)处理前后细胞活性;应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内TM、TF和TFPImRNA水平。结果:浓度为10 mg/L的LPS对细胞活力与对照组相比没有显著差异。浓度为10 mg/L的LPS作用使HUVECs显著上调TF mRNA表达,6-24 h可以使细胞TFPI mR-NA表达下调,以后渐恢复正常表达,72 h达到正常对照组水平,同时下调TM mRNA表达。结论:LPS(10 mg/L)对HUVECs的活性不造成直接的影响,可显著上调HUVECs的TF mRNA转录,抑制TFPI mRNA的转录,而不改变TMmRNA的转录,这可能与LPS在感染过程中诱导血栓形成,血液凝固和D IC发生相关。 展开更多
关键词 脂多糖类 凝血致活酶 血栓调节蛋白 脐静脉内皮细胞 基因表达
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登革2型病毒包膜蛋白在毕赤酵母中的表达和病毒样颗粒的组装 被引量:4
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作者 刘文权 江丽芳 +3 位作者 刘岩 江汉宁 汤云霞 方丹云 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期376-380,共5页
目的在组成型的毕赤酵母系统中表达登革2型病毒包膜蛋白E和前膜蛋白prM,并研究病毒样颗粒在酵母细胞中的组装特性。方法以登革2型病毒ZS01/01株mRNA为模板,扩增编码prM/E蛋白的基因。将目的基因克隆至表达载体pGAPZaA的多克隆位点,并转... 目的在组成型的毕赤酵母系统中表达登革2型病毒包膜蛋白E和前膜蛋白prM,并研究病毒样颗粒在酵母细胞中的组装特性。方法以登革2型病毒ZS01/01株mRNA为模板,扩增编码prM/E蛋白的基因。将目的基因克隆至表达载体pGAPZaA的多克隆位点,并转化毕赤酵母GS115。经Zeocin抗生素筛选和PCR鉴定后获得酵母菌重组克隆,并进行表达和鉴定。结果成功克隆登革2型病毒prM/E基因,SDS-PAGE和Western blot检测表明包膜蛋白E在组成型的毕赤酵母系统中得到高水平表达;利用透射电镜在重组酵母胞浆内检测到30-50 nm的登革2型的病毒样颗粒,并发现类似登革病毒感染的双层膜结构;免疫电镜结果证实重组病毒样颗粒可以与抗登革2型病毒血清反应,具有免疫反应性。结论成功的建立了组成型表达登革2型病毒样颗粒的毕赤酵母系统,为登革病毒样颗粒疫苗的制备奠定了基础。 展开更多
关键词 登革病毒 包膜蛋白 毕赤酵母 病毒样颗粒
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铜绿假单胞菌中I类整合子及携带的耐药基因研究 被引量:4
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作者 余广超 徐霖 +7 位作者 袁广卿 张甜 陈康 蒋岗 姜余琴 许沙沙 常彦敏 曹开源 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期711-714,共4页
目的了解整合子在广州地区铜绿假单胞菌中的分布状况及其主要类型,研究I类整合子的结构特征并探讨其与细菌多重耐药之间的相关性。方法采用PCR检测3类整合子整合酶的编码基因,并扩增整合子的可变区,运用DNA测序技术分析整合子可变区的... 目的了解整合子在广州地区铜绿假单胞菌中的分布状况及其主要类型,研究I类整合子的结构特征并探讨其与细菌多重耐药之间的相关性。方法采用PCR检测3类整合子整合酶的编码基因,并扩增整合子的可变区,运用DNA测序技术分析整合子可变区的耐药基因及其排列顺序,利用生物信息学的方法对检测到的可变区基因序列进行比对分析。结果在20株产金属-内酰胺酶铜绿假单胞菌中,15株检测到I类整合子,未检测到II类和III类整合子,其中一株铜绿假单胞菌整合子全长序列含有I类整合子整合酶、AacA4氨基糖甙乙酰转移酶、IMP-25金属-内酰胺酶、OXA-30-内酰胺酶和CatB3氯霉素乙酰转移酶的编码基因及其相应的基因重组位点,GenBank登录号为EU588392,其中IMP-25为一个新的金属-内酰胺酶亚型。结论广州地区铜绿假单胞菌中存在的整合子类型是I类整合子,并且该整合子可变区携带多种耐药基因盒,其中一个是金属-内酰胺酶新亚型IMP-25,在分子水平上阐述了I类整合子参与铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性和多重耐药性。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 整合子 金属-内酰胺酶
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E7多肽的抗原表位特性与多肽反应阳性结核患者的HLA-DR等位基因分析 被引量:4
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作者 方毅敏 任亮亮 +8 位作者 李研 冯永忠 彭毅 董涛 詹能勇 黄宇虹 程俊 马志明 赖小敏 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期163-166,171,共5页
目的:分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)E7多肽的T细胞抗原表位特性,克隆及分析E7多肽反应阳性的结核患者HLA-DR等位基因。方法:应用从结核患者末梢血分离的单个核细胞(PBMC),以IFN-γ-ELISPOT和细胞内细胞因子染色分析... 目的:分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)E7多肽的T细胞抗原表位特性,克隆及分析E7多肽反应阳性的结核患者HLA-DR等位基因。方法:应用从结核患者末梢血分离的单个核细胞(PBMC),以IFN-γ-ELISPOT和细胞内细胞因子染色分析MTB E7多肽的T细胞抗原表位特性;从E7-ELISPOT阳性反应的PBMC或胸水细胞中扩增、克隆和分析HLA-DRα和β链等位基因。结果:311例患者IFN-γ-E7-ELISPOT检测显示233例阳性(阳性率75%),阳性结果的平均SFC为210个斑点/106细胞,E7和另一多肽(E6多肽)混合检测529例患者则显示492例阳性(阳性率93%),平均SFC为572个斑点/106细胞;E7多肽刺激后,19例患者的PBMC经细胞内细胞因子染色结果显示能产生IFN-γ的CD4+T细胞百分率为0.63±1.30,而5例健康对照者为0.05±0.056,两者有显著性差异(P<0.004);扩增、克隆出了共有的HLA-DRA*0101和15种HLA-DRB1等位基因。结论:E7是一种理想的广谱HLA-DR限制性CD4+T细胞反应性多肽,为深入研究结核患者的HLA-DRB等位基因的分布特点以及制备相应四聚体建立了基础。 展开更多
关键词 结核 E7多肽 HLA-DR
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应用E7多肽/HLA-DR8四聚体监测治疗前后肺结核患者外周血多肽特异性CD4^+ T细胞的变化 被引量:5
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作者 黎意芬 黄利荣 +4 位作者 刘国标 方毅敏 李研 彭毅 赖小敏 《中国防痨杂志》 CAS 2011年第7期400-406,共7页
目的监测治疗前及治疗6个月内各时间点肺结核患者外周血E7多肽特异性CD4+T细胞及总CD4+T细胞的变化。方法应用已有的果蝇S2恒定细胞株,分别表达、纯化获得2种生物素化E7/HLA-DR8(E7/HLA-DRB1*08032和E7/HLA-DRB1*0818)复合物单体,进而... 目的监测治疗前及治疗6个月内各时间点肺结核患者外周血E7多肽特异性CD4+T细胞及总CD4+T细胞的变化。方法应用已有的果蝇S2恒定细胞株,分别表达、纯化获得2种生物素化E7/HLA-DR8(E7/HLA-DRB1*08032和E7/HLA-DRB1*0818)复合物单体,进而制备成相应四聚体,分别用2种四聚体与抗人CD4-FITC共染色,流式细胞分析检测治疗前以及规律抗结核治疗15、30、45、60、90、120、150、180 d肺结核患者外周血四聚体阳性(E7多肽特异性)CD4+ T细胞及总CD4+ T细胞,同时以健康成人对照者、非结核呼吸道感染患者外周血及脐带血作为研究对照。结果多数病例的外周血总CD4+ T细胞在治疗前略低于正常水平,随着治疗开始很快升高并在短期内恢复至正常水平;但除治疗前组与脐带血差异有统计学意义(P<0.05)外,治疗前后各组之间,以及治疗前组与健康成人、非结核呼吸道感染者之间的差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前以及规律抗结核治疗15、30、456、0 d内肺结核患者组外周血可检出高水平的四聚体阳性CD4+ T细胞,与60 d后各组及3个对照组差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05),2种四聚体之间的检测结果无统计学意义(P>0.05);肺结核患者外周血四聚体阳性CD4+ T细胞在治疗前即有较高水平,治疗15~60 d后达到最高,一些患者中间有波动,以后开始逐渐降低甚至降至正常水平。结论多肽/HLA-DR四聚体可以用于监测治疗前后结核患者外周血多肽特异性CD4+ T细胞的变化,配合总CD4+ T细胞的检测,对于治疗期结核患者疾病发展和恢复的监测具有指导意义。 展开更多
关键词 结核 肺/免疫学 CD4阳性T淋巴细胞 HLA-DR抗原
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广东省首例人禽流感H5N1 NS、M和NP基因序列测定及分子进化分析 被引量:2
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作者 周俊梅 方丹云 +4 位作者 付捷 周经姣 晏辉钧 梁瑜 江丽芳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期597-602,共6页
目的对广东省首例人禽流感H5N1的3个内部基因NP、NS和M进行克隆、测序及遗传进化分析,旨在进一步了解该病毒的来源、遗传变异及其分子进化特征。方法采集该例死亡患者尸检肺组织标本提取病毒RNA,用RT-PCR二步法进行反转录和基因扩增。... 目的对广东省首例人禽流感H5N1的3个内部基因NP、NS和M进行克隆、测序及遗传进化分析,旨在进一步了解该病毒的来源、遗传变异及其分子进化特征。方法采集该例死亡患者尸检肺组织标本提取病毒RNA,用RT-PCR二步法进行反转录和基因扩增。产物经TA克隆到载体中进行测序并对结果进行排列、拼接,参照已发表的病毒序列,对基因进行系统进化分析。结果应用随机引物和自行设计的3对特异性引物扩增出NP、NS和M基因全长cDNA序列。该3个基因同其HA、NA一样均属于A型禽流感病毒,与国内2004-2006年浙江人源病毒及湖南禽源病毒处于同一进化分支,而与香港1997年分离株相距较远。在这3个基因中,NS的变异性最大。宿主特异性相关基因及PDZ结构域配体(PL)基序分析显示其均为禽源基因。结论感染该病例的H5N1与近年在中国不同省份分离的人禽流感H5N1的系统进化分析显示它们很可能存在共同的祖先,需进一步研究不同来源病毒的亲缘关系以及病毒基因的变化是如何影响病毒的生物学特性、毒力和跨宿主传播的。 展开更多
关键词 H5N1亚型 基因 遗传进化
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应用四聚体技术检测肺结核患者外周血及病变组织C5特异性CD4^+T细胞 被引量:2
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作者 邓向斌 黄利荣 +4 位作者 谢丹 李研 刘志辉 赖小敏 谭守勇 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2012年第13期2181-2184,共4页
目的:探讨C5特异性CD4+T细胞在肺结核患者外周血及在肺病变组织中的分布。方法:应用四聚体检测肺结核患者外周血及肺病变组织C5特异性四聚体阳性CD4+T细胞,同时以健康成人及非结核呼吸道感染患者外周血和肺炎病变组织作为对照。结果:应... 目的:探讨C5特异性CD4+T细胞在肺结核患者外周血及在肺病变组织中的分布。方法:应用四聚体检测肺结核患者外周血及肺病变组织C5特异性四聚体阳性CD4+T细胞,同时以健康成人及非结核呼吸道感染患者外周血和肺炎病变组织作为对照。结果:应用C5/HLA-DRB1*090102四聚体检测肺结核组、非结核呼吸道感染组和健康成人组的C5特异性CD4+T细胞的中位数分别为0.15%、0.09%、0.03%,而C5/HLA-DRB1*130201则分别为0.19%、0.10%、0.04%,肺结核患者组外周血C5特异性CD4+T细胞的中位数高于对照组(P﹤0.05)。在肺结核患者的肺病变组织中可观察到C5特异性CD4+T细胞。结论:四聚体技术可用于结核特异性T细胞的检测,为结核特异性T细胞的进一步研究和应用奠定基础。 展开更多
关键词 结核 四聚体 CD4+T淋巴细胞
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登革1型病毒广州分离株全长E基因序列测定与分析 被引量:1
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作者 周经姣 方丹云 +2 位作者 晏辉钧 黄骥斌 江丽芳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期48-52,共5页
目的对两株登革1型病毒广州分离株(DV1-GZ01/03、DV1-GZ02/03)E基因进行序列测定及分析,了解此次分离的登革病毒流行株的可能来源及其生物学特性。方法应用RT-PCR扩增两分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,应用计算机软件与国内... 目的对两株登革1型病毒广州分离株(DV1-GZ01/03、DV1-GZ02/03)E基因进行序列测定及分析,了解此次分离的登革病毒流行株的可能来源及其生物学特性。方法应用RT-PCR扩增两分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,应用计算机软件与国内外参考株及流行株进行同源性分析,绘制系统进化树。并作毒株感染细胞及乳鼠毒力试验。结果两分离株全长E基因为1 485 bp,与登革1型Austria/83株的同源性最高,核苷酸同源性均达96.6%,氨基酸同源性分别达97.4%、97.8%;与登革1型GD23/95株次之。构建的系统进化树将19株登革1型病毒分为3个基因群。两分离株与Austria/83、GD23/95同属于基因型Ⅳ型,在同一进化分支内。两分离株颅内接种乳鼠均发病,但发病时间较晚。结论DV1-GZ01/03、DV1GZ02/03属于基因型Ⅳ型,与广东1995年流行株关系密切。乳鼠的神经毒性较弱可能与其基因变异有关。 展开更多
关键词 登革病毒 E基因 系统进化树 毒力
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Ⅱ型登革病毒E基因的克隆及其酵母表达 被引量:1
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作者 薛耀华 江丽芳 +2 位作者 魏惠永 方丹云 郭辉玉 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第4期31-33,共3页
目的 克隆 2型登革病毒E基因并用酵母真核表达 ,获得全长的重组E蛋白 ,为其结构与功能的研究提供条件。方法 从感染DEN2 (NGC株 )后病变的C6 /36细胞上清中提取RNA ,通过RT -PCR扩增E基因片段 ,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒 ,... 目的 克隆 2型登革病毒E基因并用酵母真核表达 ,获得全长的重组E蛋白 ,为其结构与功能的研究提供条件。方法 从感染DEN2 (NGC株 )后病变的C6 /36细胞上清中提取RNA ,通过RT -PCR扩增E基因片段 ,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒 ,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定 ,取Mut+菌诱导表达 ,SDS -PAGE、免疫印迹检测表达产物。结果 RT -PCR得到 1 5kb的E基因片段 ,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长E基因 ;Mut+ 酵母转化菌可分泌表达约 6 9kDa的蛋白 ,与DEN2E单抗的免疫印迹证实它为型特异的重组E蛋白。结论 成功将克隆的全长DEN2E基因在酵母菌中表达 ,获得的重组E蛋白具有免疫反应性。 展开更多
关键词 登革病毒 E基因 克隆 酵母 表达
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轻症和重症人感染H7N9禽流感病毒的致病性 被引量:1
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作者 方丹云 郭晓兰 +5 位作者 于玉凤 晏辉钧 司露露 王颖 江丽芳 周俊梅 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期828-833,共6页
【目的】研究来自不同临床类型H7N9感染者病毒分离株的致病性,探索病毒分子特性与致病差异的关系。【方法】建立人PBMC体外培养及病毒感染模型,人肺组织体外培养及病毒感染模型以及小鼠感染H7N9动物模型,分别从以上3个层次研究两株来自... 【目的】研究来自不同临床类型H7N9感染者病毒分离株的致病性,探索病毒分子特性与致病差异的关系。【方法】建立人PBMC体外培养及病毒感染模型,人肺组织体外培养及病毒感染模型以及小鼠感染H7N9动物模型,分别从以上3个层次研究两株来自轻症和重症H7N9感染者病毒分离株(即GD-6和GD-7)的感染性及病理损伤状况。【结果】两株病毒均能感染人PBMC、人肺组织体外培养模型和Balb/C小鼠的肺组织,并在其中有效复制,且GD-7的增殖能力强于GD-6。病毒主要感染人肺组织的II型肺泡上皮细胞,GD-7引起肺组织的病例变化更加明显。在小鼠肺组织,GD-7的病毒载量高于GD-6,小鼠感染病毒后其肺指数增大,肺组织的病理变化明显,且GD-7对小鼠的致病力强于GD-6。【结论】重症分离株GD-7的复制能力和致病力强于轻症分离株GD-6,结合前期研究结果 ,两株病毒存在关键氨基酸位点的差异,其中PB2蛋白的627位点在GD-7发生了突变E627K,因此推测病毒载量及关键位点突变可能对病毒的致病力起重要作用。 展开更多
关键词 H7N9禽流感病毒 感染性 致病性
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