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利用DNA免疫法制备植物选择标记基因hpt表达蛋白抗体的研究
被引量：
4
1
作者
杨丽琛
朱祯
杨晓光
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2003年第3期248-251,共4页
目的 :制备转基因作物中选择标记基因潮霉素B磷酸转移酶 (hygromycinBphosphotransferase,hpt)基因表达产物的多克隆抗体 ,并探讨影响核酸免疫效果的因素及相应机制。方法 :以hpt的cDNA全长插入真核表达载体 pCDNA3中 ,并经限制性内切...
目的 :制备转基因作物中选择标记基因潮霉素B磷酸转移酶 (hygromycinBphosphotransferase,hpt)基因表达产物的多克隆抗体 ,并探讨影响核酸免疫效果的因素及相应机制。方法 :以hpt的cDNA全长插入真核表达载体 pCDNA3中 ,并经限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定。以纯化的重组质粒pCDNA3 HPT免疫BALB/c小鼠。用在E .coli中表达并纯化的 (His) 6 HPT进行ELISA ,检测免疫过程中小鼠血清抗体效价的增长状况 ,并用Westernblot检测抗血清的特异性。结果 :经 3次核酸免疫后 ,小鼠血清中未发现明显的抗HPT抗体。第 4次加强免疫时 ,将小鼠分为 3组 ,每组两只。第 1组改用去内毒素的质粒提取试剂盒提纯的重组质粒免疫 ,第2组用 (His) 6 HPT融合蛋白免疫 ,第 3组仍用原来提取的重组质粒免疫。结果发现 ,第 1组小鼠抗血清的效价有所上升 ,经ELISA检测达 1∶2 0 0 ;第 2组抗血清的滴度显著升高 ,达到 1∶2 0 0 0 ;而第 3组小鼠血清中仍未检测到明显的抗体。Westernblot证实 ,前两组抗血清均可与亲和层析纯化的GST HPT、(His) 6 HPT融合蛋白及其诱导表达的相应菌体总蛋白发生特异性结合。结论 :用DNA免疫法成功地制备了抗hpt基因表达产物的特异性抗体 ,但抗体效价不够理想。推测与hpt基因本身的性质及其在体内表达呈现的水?
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关键词
DNA免疫法
hpt
多克隆抗体
安全性评价
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职称材料
植物选择标记基因hpt在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定
被引量：
5
2
作者
杨丽琛
常团结
+3 位作者
蔡华雅
陈宛新
杨晓光
朱祯
《高技术通讯》
EI
CAS
CSCD
2003年第6期30-36,共7页
为对hpt基因编码蛋白进行的安全性评价,建立一种简便、高效的体外微生物表达体系,以获得大量的HPT蛋白,将用于植物转化的hpt基因的全编码序列克隆到原核表达载体pGEX4T-3上,在E.coli BL21中进行诱导表达,所得融合蛋白主要以包涵体的形...
为对hpt基因编码蛋白进行的安全性评价,建立一种简便、高效的体外微生物表达体系,以获得大量的HPT蛋白,将用于植物转化的hpt基因的全编码序列克隆到原核表达载体pGEX4T-3上,在E.coli BL21中进行诱导表达,所得融合蛋白主要以包涵体的形式存在,且与Glutathione Sephrose 4B纯化介质的结合率不高。后经优化诱导表达的各种条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,该蛋白具有明显的生物活性。经Glutathione Sephrose 4B亲和层析,所得蛋白纯度>95％。动物实验显示,融合蛋白还具有良好的免疫原性,免疫家兔后可诱导产生高滴度的抗体(>1:10000)。ELISA及Western blotting检测进一步证实了所获纯化蛋白及其抗体的特性。这为深入进行HPT蛋白的安全性评价打下了良好的基础。
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关键词
植物选择标记基因
大肠杆菌
融合表达
纯化
生物活性
HPT蛋白
包涵体
可溶性
免疫原性
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职称材料
题名
利用DNA免疫法制备植物选择标记基因hpt表达蛋白抗体的研究
被引量：
4
1
作者
杨丽琛
朱祯
杨晓光
机构
中国
疾病预防控制中心营养与食品安全所卫生部微量元素营养重点
实验室
中国科学院遗传研究所植物遗传分子操作开放实验室
出处
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2003年第3期248-251,共4页
基金
国家重点基础研究发展计划 (973)项目 (2 0 0 1CB1 0 90 0 1
2 0 0 1AA2 1 2 0 4 1 )
+2 种基金
国家高技术研究发展计划 (863)项目(2 0 0 1AA2 1 2 0 4 1
2 0 0 1AA2 1 2 2 91 )
科技部转基因植物及其产品安全性评价研究专项资助 (J0 0 C 0 0 3)
文摘
目的 :制备转基因作物中选择标记基因潮霉素B磷酸转移酶 (hygromycinBphosphotransferase,hpt)基因表达产物的多克隆抗体 ,并探讨影响核酸免疫效果的因素及相应机制。方法 :以hpt的cDNA全长插入真核表达载体 pCDNA3中 ,并经限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定。以纯化的重组质粒pCDNA3 HPT免疫BALB/c小鼠。用在E .coli中表达并纯化的 (His) 6 HPT进行ELISA ,检测免疫过程中小鼠血清抗体效价的增长状况 ,并用Westernblot检测抗血清的特异性。结果 :经 3次核酸免疫后 ,小鼠血清中未发现明显的抗HPT抗体。第 4次加强免疫时 ,将小鼠分为 3组 ,每组两只。第 1组改用去内毒素的质粒提取试剂盒提纯的重组质粒免疫 ,第2组用 (His) 6 HPT融合蛋白免疫 ,第 3组仍用原来提取的重组质粒免疫。结果发现 ,第 1组小鼠抗血清的效价有所上升 ,经ELISA检测达 1∶2 0 0 ;第 2组抗血清的滴度显著升高 ,达到 1∶2 0 0 0 ;而第 3组小鼠血清中仍未检测到明显的抗体。Westernblot证实 ,前两组抗血清均可与亲和层析纯化的GST HPT、(His) 6 HPT融合蛋白及其诱导表达的相应菌体总蛋白发生特异性结合。结论 :用DNA免疫法成功地制备了抗hpt基因表达产物的特异性抗体 ,但抗体效价不够理想。推测与hpt基因本身的性质及其在体内表达呈现的水?
关键词
DNA免疫法
hpt
多克隆抗体
安全性评价
Keywords
DNA immunization
hpt
polyclonal antibodies (pAbs)
safety evaluation
分类号
R392.11 [医药卫生—免疫学]
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职称材料
题名
植物选择标记基因hpt在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定
被引量：
5
2
作者
杨丽琛
常团结
蔡华雅
陈宛新
杨晓光
朱祯
机构
中国科学院遗传研究所植物遗传分子操作开放实验室
中国
疾病预防控制中心营养与食品安全
研究所
卫生部微量元素营养重点
实验室
出处
《高技术通讯》
EI
CAS
CSCD
2003年第6期30-36,共7页
基金
863计划(2001AA212041
2001AA212291 2002AA212041)
+1 种基金
973计划(2001CB109001
2001AA2 12041)资助项目。
文摘
为对hpt基因编码蛋白进行的安全性评价,建立一种简便、高效的体外微生物表达体系,以获得大量的HPT蛋白,将用于植物转化的hpt基因的全编码序列克隆到原核表达载体pGEX4T-3上,在E.coli BL21中进行诱导表达,所得融合蛋白主要以包涵体的形式存在,且与Glutathione Sephrose 4B纯化介质的结合率不高。后经优化诱导表达的各种条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,该蛋白具有明显的生物活性。经Glutathione Sephrose 4B亲和层析,所得蛋白纯度>95％。动物实验显示,融合蛋白还具有良好的免疫原性,免疫家兔后可诱导产生高滴度的抗体(>1:10000)。ELISA及Western blotting检测进一步证实了所获纯化蛋白及其抗体的特性。这为深入进行HPT蛋白的安全性评价打下了良好的基础。
关键词
植物选择标记基因
大肠杆菌
融合表达
纯化
生物活性
HPT蛋白
包涵体
可溶性
免疫原性
Keywords
hpt,Safety assessment,Fusion expression, Inclusion body,Soluble expression, Activity assay
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
利用DNA免疫法制备植物选择标记基因hpt表达蛋白抗体的研究
杨丽琛
朱祯
杨晓光
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2003
4
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
植物选择标记基因hpt在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定
杨丽琛
常团结
蔡华雅
陈宛新
杨晓光
朱祯
《高技术通讯》
EI
CAS
CSCD
2003
5
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职称材料
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