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基于主成分分析的多重定量PCR荧光串扰校正
1
作者
王鹏
王振亚
+8 位作者
汪舜
张杰
张哲
杨天航
王弼陡
罗刚银
翁良飞
张翀宇
李原
《光谱学与光谱分析》
SCIE
EI
CAS
CSCD
北大核心
2024年第4期1151-1157,共7页
聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用的检测手段,主要用于对生物的DNA或RNA进行检测。由于荧光光谱重叠和滤光片过滤带宽限制,检测时所获得的荧光数据通常会包含荧光通道之间的串扰,串扰的存在使PCR结果分析变得复杂,并可能影响最终的...
聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用的检测手段,主要用于对生物的DNA或RNA进行检测。由于荧光光谱重叠和滤光片过滤带宽限制,检测时所获得的荧光数据通常会包含荧光通道之间的串扰,串扰的存在使PCR结果分析变得复杂,并可能影响最终的检测结果。选择合适的光学元件,并确定通道间的补偿矩阵,可以降低甚至消除荧光串扰。目前荧光补偿矩阵大多通过迭代计算获得,还没有一种简单的方法可以从混合的多通道荧光数据中找到荧光补偿矩阵。为了快速获得荧光补偿矩阵,减小计算量,采用主成分分析法(PCA)中确定主成分的方式,基于搭建的测试平台进行单一染料实验,获得染料的荧光信号在各个检测通道的分布情况,计算得到荧光补偿矩阵。通过分析补偿矩阵,发现对于搭建的硬件系统,Cy5染料对Cy5.5通道串扰较大,串扰比例为8.76%,同时Cy5.5染料对Cy5通道串扰影响也相对较大,比例约为6.2%;其次是ROX染料对HEX通道串扰,比例约为2.68%;HEX染料对FAM通道串扰,比例约为1.58%;FAM染料对HEX通道串扰相对较小,比例约为0.25%,其余通道无明显串扰,与荧光光谱反映的结果一致。采用得到的荧光补偿矩阵对单一染料实验得到的原始荧光数据进行处理,有效去除了非目标通道的荧光串扰,实现了荧光通道数据的解耦,验证了方法的可行性。最后设计了染料颜色分辨实验,将不同浓度的多种染料进行组合测试,并采用所提出的方法将得到的数据进行荧光补偿。实验结果表明,荧光通道各自的线性相关性较高,五个荧光通道的线性相关系数r均大于0.99,该结果进一步验证了该补偿方法的有效性。
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关键词
聚合酶链式反应(PCR)检测
光谱分析
主成分分析
多重荧光检测
荧光串扰
荧光分离
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职称材料
题名
基于主成分分析的多重定量PCR荧光串扰校正
1
作者
王鹏
王振亚
汪舜
张杰
张哲
杨天航
王弼陡
罗刚银
翁良飞
张翀宇
李原
机构
中国科
学
技术
大学
生物医学
工程
学院
(
苏州
)
中国科学院苏州生物医学工程技术研究所工程化研究中心
重庆国科医创科技发展有限公司分子诊断
中心
出处
《光谱学与光谱分析》
SCIE
EI
CAS
CSCD
北大核心
2024年第4期1151-1157,共7页
基金
国家重点研发计划课题(2020YFA0707902)
战略性先导科技专项(A类)(XDA16021102)资助。
文摘
聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用的检测手段,主要用于对生物的DNA或RNA进行检测。由于荧光光谱重叠和滤光片过滤带宽限制,检测时所获得的荧光数据通常会包含荧光通道之间的串扰,串扰的存在使PCR结果分析变得复杂,并可能影响最终的检测结果。选择合适的光学元件,并确定通道间的补偿矩阵,可以降低甚至消除荧光串扰。目前荧光补偿矩阵大多通过迭代计算获得,还没有一种简单的方法可以从混合的多通道荧光数据中找到荧光补偿矩阵。为了快速获得荧光补偿矩阵,减小计算量,采用主成分分析法(PCA)中确定主成分的方式,基于搭建的测试平台进行单一染料实验,获得染料的荧光信号在各个检测通道的分布情况,计算得到荧光补偿矩阵。通过分析补偿矩阵,发现对于搭建的硬件系统,Cy5染料对Cy5.5通道串扰较大,串扰比例为8.76%,同时Cy5.5染料对Cy5通道串扰影响也相对较大,比例约为6.2%;其次是ROX染料对HEX通道串扰,比例约为2.68%;HEX染料对FAM通道串扰,比例约为1.58%;FAM染料对HEX通道串扰相对较小,比例约为0.25%,其余通道无明显串扰,与荧光光谱反映的结果一致。采用得到的荧光补偿矩阵对单一染料实验得到的原始荧光数据进行处理,有效去除了非目标通道的荧光串扰,实现了荧光通道数据的解耦,验证了方法的可行性。最后设计了染料颜色分辨实验,将不同浓度的多种染料进行组合测试,并采用所提出的方法将得到的数据进行荧光补偿。实验结果表明,荧光通道各自的线性相关性较高,五个荧光通道的线性相关系数r均大于0.99,该结果进一步验证了该补偿方法的有效性。
关键词
聚合酶链式反应(PCR)检测
光谱分析
主成分分析
多重荧光检测
荧光串扰
荧光分离
Keywords
Polymerase chain reaction(PCR)detection
Spectral analysis
Principal component analysis
Multiple fluorescence detection
Fluorescent crosstalk
Fluorescence separation
分类号
TH79 [机械工程—精密仪器及机械]
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1
基于主成分分析的多重定量PCR荧光串扰校正
王鹏
王振亚
汪舜
张杰
张哲
杨天航
王弼陡
罗刚银
翁良飞
张翀宇
李原
《光谱学与光谱分析》
SCIE
EI
CAS
CSCD
北大核心
2024
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