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CELL-SELEX筛选膀胱癌核酸适配体的细胞学研究
1
作者
平秦榕
李翀
+4 位作者
梁剑伟
刘杨文易
雷容
王剑松
颜汝平
《医学研究生学报》
CAS
北大核心
2020年第7期708-714,共7页
目的基于膀胱癌标志物的早期诊断和术后复发监测方法是目前的研究热点。文中利用CELL-SELEX技术筛选出可特异性识别膀胱癌细胞系(EJ、T24、BIU87)的核酸适配体。方法以人膀胱癌细胞系EJ、T24和BIU87为阳性质控细胞,以HCV29(人正常尿路...
目的基于膀胱癌标志物的早期诊断和术后复发监测方法是目前的研究热点。文中利用CELL-SELEX技术筛选出可特异性识别膀胱癌细胞系(EJ、T24、BIU87)的核酸适配体。方法以人膀胱癌细胞系EJ、T24和BIU87为阳性质控细胞,以HCV29(人正常尿路上皮细胞系)、293T(人胚肾细胞系)、huh7(人肝癌细胞系)为阴性质控细胞,进行CELL-SELEX筛选。PCR上游引物5’端标记FITC,下游引物5’端标记Biotin,将每一轮次筛选得到的ssDNA作为模板进行PCR扩增、纯化。利用生物素-链亲和素磁珠分离法将PCR纯化产物进行分离后获得次级FITC-ssDNA用于下一轮次的筛选,流式细胞仪监测CELL-SELEX筛选进程。选取与膀胱癌细胞系EJ、T24和BIU87结合率最高轮次的ssDNA文库进行PCR扩增、产物纯化、分子克隆和测序;根据测序结果,利用Dnaman软件模拟核酸适配体的二级结构。体外合成FITC标记的适配体,流式细胞仪检测适配体与EJ、T24和BIU87的结合率。结果随着CELL-SELEX流程的推进,FITC-ssDNA与EJ、T24和BIU87细胞的结合率逐渐增加;第15轮FITC-ssDNA与EJ结合率最高,文库中apt1富集度最高;第18轮FITC-ssDNA与T24、BIU87结合率最高,文库中apt2和apt3富集度最高。DNA结构预测分析显示apt1、apt2和apt3的二级结构主要为茎环结构。流式细胞仪检测:FITC-apt1可特异性识别EJ细胞,阳性率达71.5%。FITC-apt2与T24细胞的结率明显高于BIU87细胞。FITC-apt3与BIU87细胞的结合率明显高于T24细胞。FITC-apt2可特异性识别T24细胞,阳性率达63.9%。FITC-apt3可特异性识别BIU87细胞,阳性率达74.7%。结论利用CELL-SELEX技术筛选出可识别膀胱癌细胞系的适配体。其中适配体apt1可特异性识别EJ细胞,适配体apt2可特异性识别T24细胞,适配体apt3可特异性识别BIU87细胞,为膀胱癌早期诊断和靶向治疗技术的研发提供了实验依据。
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关键词
CELL-SELEX
膀胱癌
适配体
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题名
CELL-SELEX筛选膀胱癌核酸适配体的细胞学研究
1
作者
平秦榕
李翀
梁剑伟
刘杨文易
雷容
王剑松
颜汝平
机构
昆明医科大学第二附属医院泌尿外科/云南省泌尿外科
研究所
中国科学院生物物理研究所感染与免疫重点实验室
出处
《医学研究生学报》
CAS
北大核心
2020年第7期708-714,共7页
基金
云南省科技惠民计划项目(2014RA067)
云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项资金项目[2017FE467(-061)]。
文摘
目的基于膀胱癌标志物的早期诊断和术后复发监测方法是目前的研究热点。文中利用CELL-SELEX技术筛选出可特异性识别膀胱癌细胞系(EJ、T24、BIU87)的核酸适配体。方法以人膀胱癌细胞系EJ、T24和BIU87为阳性质控细胞,以HCV29(人正常尿路上皮细胞系)、293T(人胚肾细胞系)、huh7(人肝癌细胞系)为阴性质控细胞,进行CELL-SELEX筛选。PCR上游引物5’端标记FITC,下游引物5’端标记Biotin,将每一轮次筛选得到的ssDNA作为模板进行PCR扩增、纯化。利用生物素-链亲和素磁珠分离法将PCR纯化产物进行分离后获得次级FITC-ssDNA用于下一轮次的筛选,流式细胞仪监测CELL-SELEX筛选进程。选取与膀胱癌细胞系EJ、T24和BIU87结合率最高轮次的ssDNA文库进行PCR扩增、产物纯化、分子克隆和测序;根据测序结果,利用Dnaman软件模拟核酸适配体的二级结构。体外合成FITC标记的适配体,流式细胞仪检测适配体与EJ、T24和BIU87的结合率。结果随着CELL-SELEX流程的推进,FITC-ssDNA与EJ、T24和BIU87细胞的结合率逐渐增加;第15轮FITC-ssDNA与EJ结合率最高,文库中apt1富集度最高;第18轮FITC-ssDNA与T24、BIU87结合率最高,文库中apt2和apt3富集度最高。DNA结构预测分析显示apt1、apt2和apt3的二级结构主要为茎环结构。流式细胞仪检测:FITC-apt1可特异性识别EJ细胞,阳性率达71.5%。FITC-apt2与T24细胞的结率明显高于BIU87细胞。FITC-apt3与BIU87细胞的结合率明显高于T24细胞。FITC-apt2可特异性识别T24细胞,阳性率达63.9%。FITC-apt3可特异性识别BIU87细胞,阳性率达74.7%。结论利用CELL-SELEX技术筛选出可识别膀胱癌细胞系的适配体。其中适配体apt1可特异性识别EJ细胞,适配体apt2可特异性识别T24细胞,适配体apt3可特异性识别BIU87细胞,为膀胱癌早期诊断和靶向治疗技术的研发提供了实验依据。
关键词
CELL-SELEX
膀胱癌
适配体
Keywords
CELL-SELEX
bladder cancer
aptamer
分类号
R737.14 [医药卫生—肿瘤]
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作者
出处
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1
CELL-SELEX筛选膀胱癌核酸适配体的细胞学研究
平秦榕
李翀
梁剑伟
刘杨文易
雷容
王剑松
颜汝平
《医学研究生学报》
CAS
北大核心
2020
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