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人线粒体亮氨酰tRNA合成酶的表达、纯化及其动力学研究(英文)
1
作者
汪振诚
王学敏
+2 位作者
金由辛
缪明永
焦炳华
《第二军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2003年第10期1081-1085,共5页
目的:构建含人线粒体亮氨酰tRNA合成酶(mtLeuRS)基因的重组表达载体,表达纯化mtLeuRS并检测其酶促动力学参数。方法:克隆mtLeuRS基因,构建入pET-24a(+)表达载体,转化大肠杆菌BL21-codonPlus(DE3)-RIL,经诱导产生带6-His标签的mtLeuRS融...
目的:构建含人线粒体亮氨酰tRNA合成酶(mtLeuRS)基因的重组表达载体,表达纯化mtLeuRS并检测其酶促动力学参数。方法:克隆mtLeuRS基因,构建入pET-24a(+)表达载体,转化大肠杆菌BL21-codonPlus(DE3)-RIL,经诱导产生带6-His标签的mtLeuRS融合蛋白,再经Ni2+亲和层析柱一步法纯化后用酶促反应检测其氨酰化活力。作为mtLeuRS酶促反应底物,人tRNALeu(UUR)由T7 RNA聚合酶体外转录生成。结果:经IPTG诱导,人mtLeuRS蛋白表达量约占细菌总蛋白量的1％～2％,1 L培养液的菌体内可收获约2 mg的纯化酶蛋白。通过体外转录生成的酶底物tRNALeu(UUR)可达转录模板的100倍。经酶促反应,人mtLeuRS可氨酰化人线粒体内tRNALeu(UUR)。反应的亲和常数(Km)为16.67μmol/L,催化常数(Kcat)为0.17s-1。结论:本实验成功克隆并表达了人mtLeuRS,并成功用于催化tRNALeu(UUR)的氨酰化。
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关键词
线粒体
亮氨酰tRNA合成酶
基因表达
动力学
纯化
酶促动力学参数
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职称材料
题名
人线粒体亮氨酰tRNA合成酶的表达、纯化及其动力学研究(英文)
1
作者
汪振诚
王学敏
金由辛
缪明永
焦炳华
机构
第二军医大学基础医学部
生物
化学与
分子生物学
教研室
中国科学院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室
出处
《第二军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2003年第10期1081-1085,共5页
基金
This work is supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30171030).
文摘
目的:构建含人线粒体亮氨酰tRNA合成酶(mtLeuRS)基因的重组表达载体,表达纯化mtLeuRS并检测其酶促动力学参数。方法:克隆mtLeuRS基因,构建入pET-24a(+)表达载体,转化大肠杆菌BL21-codonPlus(DE3)-RIL,经诱导产生带6-His标签的mtLeuRS融合蛋白,再经Ni2+亲和层析柱一步法纯化后用酶促反应检测其氨酰化活力。作为mtLeuRS酶促反应底物,人tRNALeu(UUR)由T7 RNA聚合酶体外转录生成。结果:经IPTG诱导,人mtLeuRS蛋白表达量约占细菌总蛋白量的1％～2％,1 L培养液的菌体内可收获约2 mg的纯化酶蛋白。通过体外转录生成的酶底物tRNALeu(UUR)可达转录模板的100倍。经酶促反应,人mtLeuRS可氨酰化人线粒体内tRNALeu(UUR)。反应的亲和常数(Km)为16.67μmol/L,催化常数(Kcat)为0.17s-1。结论:本实验成功克隆并表达了人mtLeuRS,并成功用于催化tRNALeu(UUR)的氨酰化。
关键词
线粒体
亮氨酰tRNA合成酶
基因表达
动力学
纯化
酶促动力学参数
Keywords
leucyl-tRNA synthetase
mitochondrial
gene expression
kinetics
分类号
Q786 [生物学—分子生物学]
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作者
出处
发文年
被引量
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1
人线粒体亮氨酰tRNA合成酶的表达、纯化及其动力学研究(英文)
汪振诚
王学敏
金由辛
缪明永
焦炳华
《第二军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2003
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