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橡胶树HbMVD1基因启动子克隆及转录调控因子筛选
1
作者 文连璇 杨署光 +2 位作者 史敏晶 邓小敏 晁金泉 《热带作物学报》 北大核心 2025年第8期1785-1794,共10页
转录调控是生命活动的重要调控方式之一。天然橡胶是一种重要的工业原材料,主要来源于橡胶树。天然橡胶生物合成的转录调控是近年来橡胶树基础研究领域的热点之一。焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)是天然橡胶生物合成途径的关键酶,目前对其... 转录调控是生命活动的重要调控方式之一。天然橡胶是一种重要的工业原材料,主要来源于橡胶树。天然橡胶生物合成的转录调控是近年来橡胶树基础研究领域的热点之一。焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)是天然橡胶生物合成途径的关键酶,目前对其转录调控尚不清楚。本研究克隆了长度为1500 bp的橡胶树HbMVD1启动子,序列分析显示其含有茉莉酸响应、乙烯响应、机械伤害响应、光响应、MYC结合等顺式作用元件。自激活抑制梯度试验显示,AbA浓度为100 ng/mL时,pAbAi-pHbMVD1诱饵载体的转录自激活得到有效抑制。利用酵母单杂交技术从橡胶树胶乳酵母cDNA文库共筛选到13个与HbMVD1启动子结合的非冗余蛋白,包括1个WRKY转录因子(HbWRKY1)、1个热激转录因子、1个G-box结合因子。组织特异性分析显示这些蛋白的编码基因在不同组织间存在不同的表达模式。转录调控分析显示HbWRKY1在体内可以激活HbMVD1基因的表达。分子对接发现,HbWRKY1与HbMVD1启动子的机械伤害响应元件结合,并鉴定到11个潜在的氨基酸结合位点。本研究为进一步揭示橡胶树HbMVD1转录调控网络奠定基础。 展开更多
关键词 橡胶树 HbMVD1启动子 酵母单杂交 转录因子 转录调控
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橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库构建及HbHDA6互作蛋白筛选 被引量：1
2
作者 张世鑫 吴绍华 +5 位作者 杨署光 晁金泉 史敏晶 葛立鑫 蒋毅 田维敏 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期245-256,共12页
次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来。次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标。前期研究... 次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来。次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标。前期研究中,我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)能诱导橡胶树乳管分化且组蛋白去乙酰化酶基因(HbHDA6)能够参与橡胶树乳管分化调控。由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制尚未阐明,因此该文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化产生次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以HbHDA6基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与HbHDA6相互作用的蛋白。结果表明:(1)利用Gateway技术构建的均一化COR诱导橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库,初级文库的容量为6.34×10^(6)CFU·mL^(-1),总单克隆数为1.27×10^(7),文库重组率为100%;次级文库的容量为7.72×10^(6)CFU·mL^(-1),总单克隆数为1.54×10^(7),文库重组率为100%。初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为1.1 kb和1.2 kb。(2)成功构建了筛选HbHDA6互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6诱饵载体,并确认无自激活活性。(3)使用该诱饵载体对构建的酵母双杂交cDNA文库进行筛选,并通过NCBI_BLAST比对和去除重复以后,获得了22个与HbHDA6发生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6等。该研究成果为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供了理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供了候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供了新线索。 展开更多
关键词 巴西橡胶树 次生乳管分化 维管形成层 酵母双杂交 HbHDA6
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冠菌素诱导橡胶树次生乳管分化的形成层细胞CUT&Tag文库构建和初步分析
3
作者 张世鑫 葛立鑫 +5 位作者 吴绍华 晁金泉 杨署光 史敏晶 张华 田维敏 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第10期2010-2024,共15页
CUT&Tag技术是一种研究蛋白质-DNA互作的新方法,使用超高活性的新型pG-Tn5转座酶,在抗体引导下精准靶向切割目的蛋白附近的DNA序列,从而进行cDNA建库和测序分析。此技术在人类和动物研究中应用广泛,由于植物细胞结构特殊,该技术在... CUT&Tag技术是一种研究蛋白质-DNA互作的新方法,使用超高活性的新型pG-Tn5转座酶,在抗体引导下精准靶向切割目的蛋白附近的DNA序列,从而进行cDNA建库和测序分析。此技术在人类和动物研究中应用广泛,由于植物细胞结构特殊,该技术在植物研究中应用较少。在前期研究中,我们发现组蛋白乙酰化修饰参与茉莉酸诱导橡胶树次生乳管分化的调控,但其分子机制尚未阐明。本研究利用冠菌素(COR)诱导橡胶树萌条维管形成层分化次生乳管的实验系统,通过酶解法获取高质量的形成层区细胞原生质体,使用组蛋白H3乙酰化修饰抗体对次生乳管分化过程中发生组蛋白乙酰化修饰的区域进行原位识别,采用CUT&Tag技术成功构建COR处理橡胶树树皮形成层细胞的cDNA文库。对构建cDNA文库进行质检和测序分析,发现文库质量较好,并通过差异基因的GO和KEGG富集分析,发现生长素、类黄酮代谢和蛋白质泛素化等相关基因得到富集。本研究结果为使用CUT&Tag技术构建植物组织的cDNA文库提供操作方法,为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供理论基础。 展开更多
关键词 巴西橡胶树 次生乳管分化 维管形成层 原生质体 组蛋白乙酰化 CUT&Tag
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巴西橡胶树HbPSKR2基因克隆及互作蛋白鉴定 被引量：1
4
作者 杜晓愚 赵一杰 +2 位作者 张世鑫 田维敏 晁金泉 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第4期653-662,共10页
磺肽素是一种高等植物特有的小肽类激素,广泛参与植物的生长发育、分裂分化、生物或非生物胁迫等生物学过程。磺肽素受体蛋白(phytosulfokine receptor,PSKR)是磺肽素的直接受体,对于磺肽素信号传导至关重要。本研究采用RT-PCR(reverse ... 磺肽素是一种高等植物特有的小肽类激素,广泛参与植物的生长发育、分裂分化、生物或非生物胁迫等生物学过程。磺肽素受体蛋白(phytosulfokine receptor,PSKR)是磺肽素的直接受体,对于磺肽素信号传导至关重要。本研究采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)技术克隆了橡胶树的HbPSKR2基因,并对其进行生物信息学、基因表达模式、互作蛋白筛选及鉴定分析。结果显示HbPSKR2基因的开放阅读框全长3159 bp,编码1052个氨基酸,理论分子量为114.84 kDa,理论等电点为6.34。结构域分析显示HbPSKR2属于典型的跨膜蛋白,前640个氨基酸是由亮氨酸重复组成的天线结构,第692~714个氨基酸是跨膜结构域,第765~1052个氨基酸是膜内激酶结构域。对HbPSKR2膜内激酶结构域以及拟南芥和水稻的PSKR同源序列进行多重比对,结果显示均存在ATP binding site、CaM binding site、Activation segment、GC Centre等保守性位点。表达模式分析显示,HbPSKR2基因在橡胶树形成层区高丰度表达,其表达量在冠菌素处理前期显著上升。通过酵母双杂交技术筛选到12个与HbPSKR2互作的候选蛋白,并对其中的2个蛋白激酶(HbPBL8和HbPIX13)与HbPSKR2的互作关系进行荧光素酶互补成像验证。结果显示,在烟草中共转化HbPSKR2-nLUC/HbPBL8-cLUC和HbPSKR2-nLUC/HbPIX13-cLUC可以观察到强烈的荧光信号,进一步证明了HbPSKR2在体内可与HbPBL8激酶和HbPIX13激酶互作。橡胶树HbPSKR2基因克隆及互作蛋白鉴定将为深入揭示橡胶树乳管分化分子机制提供新的思路。 展开更多
关键词 巴西橡胶树 HbPSKR2 酵母双杂交 荧光素酶互补成像 互作蛋白
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巴西橡胶树GRAS基因家族鉴定及表达分析
5
作者 李娟 袁渊 +2 位作者 吴挺开 邓治 程汉 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第9期1761-1779,共19页
GRAS是植物特有的转录因子,在植物生长发育过程以及非生物胁迫应答中具有重要的调控作用,然而在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中还未见关于该基因家族的报道。本研究利用生物信息学工具分析巴西橡胶树GRAS基因家族成员的蛋白质理化性... GRAS是植物特有的转录因子,在植物生长发育过程以及非生物胁迫应答中具有重要的调控作用,然而在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中还未见关于该基因家族的报道。本研究利用生物信息学工具分析巴西橡胶树GRAS基因家族成员的蛋白质理化性质、系统进化关系、基因结构、染色体位置及启动子顺式作用元件,利用转录组数据及实时荧光定量PCR(qPCR)分析橡胶树GRAS基因的表达模式。结果表明:在巴西橡胶树基因组中共鉴定到91个GRAS家族成员,分别命名为HbGRAS1~HbGRAS91,其分子量在14.07~89.46 kDa之间。亚细胞定位预测结果显示,HbGRAS蛋白主要定位于细胞核和叶绿体。系统发育分析将其划分为14个亚家族,同一亚族成员的基因结构和基序组成较为保守。橡胶树GRAS基因分布在除11号染色体外的其他17条染色体和2条Scaffold上,其中17个HbGRAS基因组成10个串联重复事件。共线性分析显示,片段重复区域中有87个HbGRAS基因,说明片段重复可能是橡胶树GRAS基因扩张的主要驱动力。启动子顺式作用元件分析显示,橡胶树GRAS家族包含多个植物激素和胁迫应答顺式作用元件。HbGRAS基因表达具有组织特异性,并与橡胶树叶片发育有关。GRAS亚家族成员DELLA基因的表达与橡胶树木质部发育有关并受赤霉素(gibberellin,GA)抑制。本研究结果为橡胶树GRAS基因的功能研究提供参考。 展开更多
关键词 巴西橡胶树 GRAS基因家族 生物信息学 基因表达 DELLA
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橡胶树HbACS2关键氨基酸位点的鉴定
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作者 毛嘉诚 龙翔宇 +5 位作者 曾力旺 阳江华 胡斌 方永军 郝园园 秦云霞 《江西农业大学学报》 CSCD 北大核心 2024年第6期1533-1543,共11页
【目的】乙酰辅酶A合成酶(ACS,EC 6.2.1.1)是细胞代谢过程中的一种重要酶,能在ATP供能的条件下催化乙酸与辅酶A生成乙酰辅酶A。此前研究发现,橡胶树中的一个ACS成员,Hb ACS2,影响乳管细胞中乙酸的代谢平衡,与橡胶树胶乳再生能力密切相关... 【目的】乙酰辅酶A合成酶(ACS,EC 6.2.1.1)是细胞代谢过程中的一种重要酶,能在ATP供能的条件下催化乙酸与辅酶A生成乙酰辅酶A。此前研究发现,橡胶树中的一个ACS成员,Hb ACS2,影响乳管细胞中乙酸的代谢平衡,与橡胶树胶乳再生能力密切相关,然而该酶的酶活调控机制尚不清楚。有关微生物和模式植物中的研究表明,ACS酶活与其关键氨基酸位点及某些关键赖氨酸位点的乙酰化修饰状态有关。因此,探究Hb ACS2的酶活调控机制,对其关键氨基酸进行筛选十分必要。【方法】针对Hb ACS2的氨基酸组成特点,本试验选择Hb ACS2中3个保守的赖氨酸(K)位点(K298,K342和K723),通过定点突变方式,分别将它们替换为丙氨酸(A)、精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q),并构建原核表达载体。随后这些变体蛋白与野生型蛋白通过原核表达体系进行诱导、表达和Ni-NTA琼脂糖纯化,并以纯化的野生型蛋白作为对照,采用体外酶活分析方法比较野生型和变体蛋白在底物乙酸结合能力及酶活方面的差异。【结果】Hb ACS2的K723位点突变对酶活性影响最为显著,K723A和K723R变体蛋白完全失去酶活,K723Q的酶活性降低了180倍。此外,K298位点的突变也显著降低了变体蛋白的酶活性,改变了对乙酸的亲和力,其中K298Q变体蛋白变化最大,其酶活降低17.85倍,K_(m)=0.06 mmol/L,亲和力增加了6.5倍;K298A的酶活降低了约4倍,K_(m)=0.7543 mmol/L,对底物的亲和力降低了接近一倍;K298R的酶活降低了约3.7倍,K_(m)=0.1827 mmol/L,对底物的亲和力增加了一倍;相比之下,K342位点的突变,对3个变体蛋白的酶活影响最小,其中,K342R变体蛋白的酶活降低了2.75倍,K_(m)=0.074 mmol/L,亲和力增加了5.3倍,而K342A和K342Q的酶活则分别降低了42%和14%,对乙酸的结合力增加了34%和17%。【结论】该研究结果证实了Hb ACS2中关键赖氨酸位点对其酶活和底物亲和力影响很大,为进一步揭示ACS活性调控机制提供了参考依据。 展开更多
关键词 橡胶树 乙酰辅酶A合成酶 乙酸 乙酰辅酶A 乙酰化
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