应用于彗星试验的新型技术研究进展

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作者 王敬亭 周长慧 常艳 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2020年第6期474-480,共7页

彗星试验是一种用途广泛的检测方法,可检测到由于衰老、疾病和暴露导致的各种生物体、组织和细胞类型的DNA损伤。为满足遗传毒性检测简单、快速、高通量和更好预测化合物在体内作用的需求,彗星试验正作为一种遗传毒性测试工具进一步升级... 彗星试验是一种用途广泛的检测方法,可检测到由于衰老、疾病和暴露导致的各种生物体、组织和细胞类型的DNA损伤。为满足遗传毒性检测简单、快速、高通量和更好预测化合物在体内作用的需求,彗星试验正作为一种遗传毒性测试工具进一步升级,如将彗星试验各个步骤优化并集成到一组彗星芯片平台中,开发出一种简单和快速的彗星试验方法;使用更接近人体细胞的三维(3D)组织模型(3D皮肤模型、3D肝模型、3D气道模型和3D重建眼角膜上皮模型)降低体外检测的假阳性率;开发新型的人源化动物模型,减少不同物种带来试验结果的差异,提高预测化合物对人体遗传毒性的能力。随着细胞生物学、医学和材料科学领域的发展,彗星试验技术将持续改进,使其更广泛、更有效地应用于药物、化妆品、环境和生态等领域的遗传毒性评价和研究。 展开更多

关键词 彗星试验 彗星芯片 三维组织 人肝细胞嵌合小鼠

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循环miR⁃124作为铅神经毒性标志物的灵敏性、稳定性和组织特异性研究

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作者 周慧 王雁 +3 位作者 李华 汪溪洁 陈华英 马璟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第2期154-161,共8页

目的:验证循环微小核糖核酸(microRNA,miRNA)⁃124的稳定性、组织特异性及其检测铅神经毒性的灵敏性,为循环miR⁃124用于铅神经毒性评价提供依据。方法:采用Zea⁃Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型,采集血液样本离心、分装后立即检测... 目的:验证循环微小核糖核酸(microRNA,miRNA)⁃124的稳定性、组织特异性及其检测铅神经毒性的灵敏性,为循环miR⁃124用于铅神经毒性评价提供依据。方法:采用Zea⁃Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型,采集血液样本离心、分装后立即检测或在室温、2~8℃和-70~-90℃条件下储存不同时间后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real⁃time polymerase chain reaction,RT⁃qPCR)检测miR⁃124的表达;分别使用对乙酰氨基酚(1250 mg/kg)、异丙肾上腺素(2.5 mg/kg)和庆大霉素(80 mg/kg)建立大鼠肝毒性、心脏毒性和肾毒性模型,采集血液样本检测并比较造模前后循环miR⁃124的变化;使用醋酸铅(300、600 mg/kg)建立大鼠神经毒性模型,采用酶联免疫吸附测定方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测白细胞介素(interleukin,IL)⁃10、IL⁃1β和肿瘤坏死因子⁃α(tumor necrosis factorα,TNF⁃α)的变化,比较检测到细胞因子和循环miR⁃124含量变化的时间评估其灵敏性。结果:以新鲜血液样本作为对照,血液样本室温保存6 h,2~8℃保存24 h,-70~-90℃保存36 d以及3次冻融后循环miR⁃124仍保持稳定,稳定性可以支持实验室需求;循环miR⁃124在大鼠肝毒性、心脏毒性和肾毒性模型中均无明显改变,具有良好的组织特异性;与细胞因子相比,循环miR⁃124可以更灵敏地检测铅暴露引起的神经炎症。结论:循环miR⁃124具有良好的稳定性、组织特异性和灵敏性,可作为评价铅神经毒性的潜在的生物标志物。 展开更多

关键词 循环miR⁃124 生物标志物验证 灵敏性 稳定性 组织特异性

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病毒载体遗传毒性评价方法研究进展

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作者 何伟伟 周长慧 +5 位作者 郑明岚 李嫚琪 崔文腾 方雅励 王晓炜 常艳 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2024年第4期314-320,共7页

随着基因治疗产品逐渐进入市场,迫切需要建立病毒载体介导的遗传毒性评价方法。目前应用广泛的病毒载体主要有2种:慢病毒载体和腺相关病毒载体。慢病毒载体能够稳定整合到宿主基因组中;而腺相关病毒载体基因组在宿主细胞核中主要以附加... 随着基因治疗产品逐渐进入市场,迫切需要建立病毒载体介导的遗传毒性评价方法。目前应用广泛的病毒载体主要有2种:慢病毒载体和腺相关病毒载体。慢病毒载体能够稳定整合到宿主基因组中;而腺相关病毒载体基因组在宿主细胞核中主要以附加体形式存在,仍能以低频率随机整合到宿主细胞基因组中,其整合方式包括随机整合和靶向整合。本文对已有的病毒载体介导的遗传毒性评价方法,包括脱靶修饰的全基因组分析、整合位点分析、核型分析和评估细胞转化潜力试验等进行综述,并对建立准确快速的病毒载体介导的遗传毒性的评价体系予以展望,以期为进一步完善和研发新的病毒载体遗传毒性评价方法提供参考。 展开更多

关键词 基因治疗 病毒载体 整合 遗传毒性

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雷公藤甲素生殖毒性及其防治策略研究进展 被引量：7

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作者 李英奇 王恒 +3 位作者 李嫚琪 杨紫轩 许瀚林 常艳 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2022年第2期155-160,共6页

雷公藤甲素是传统中药雷公藤中最主要的生物活性成分,具有抗癌、抗炎和免疫抑制等功效,临床上用于治疗肿瘤,类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫疾病。然而,雷公藤甲素具有严重的生殖毒性,会造成精子数量减少和活力下降,直接损伤... 雷公藤甲素是传统中药雷公藤中最主要的生物活性成分,具有抗癌、抗炎和免疫抑制等功效,临床上用于治疗肿瘤,类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫疾病。然而,雷公藤甲素具有严重的生殖毒性,会造成精子数量减少和活力下降,直接损伤睾丸、卵巢和子宫等,其毒性机制主要与氧化应激、线粒体损伤,及乳腺癌耐药蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体和半胱氨酸蛋白酶3等蛋白表达异常及支持细胞、间质细胞、生精上皮细胞、线粒体和溶酶体等中的标志酶活力下降相关。可通过雷公藤甲素毒性缓解药物、化学结构修饰和新型递药系统等方式缓解雷公藤甲素的生殖毒性。本文主要对雷公藤甲素的生殖毒性、毒性机制及缓解措施的最新研究进展进行综述,为其临床合理应用提供依据。 展开更多

关键词 雷公藤甲素 生殖毒性 作用机制 缓解措施

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细胞治疗产品非临床活体示踪方法研究进展 被引量：3

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作者 王舒哲 许波华 +2 位作者 王雁 黄芳华 邱云良 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2021年第8期624-631,共8页

细胞治疗作为肿瘤学研究和临床实践中的新型疗法,通过修复受损组织或替换身体缺陷细胞,在多种疾病治疗中发挥着越来越重要的作用。但对细胞治疗产品治疗疾病的机制和细胞移植后的宿主体内的分布和迁移情况并不非常清楚。细胞治疗产品的... 细胞治疗作为肿瘤学研究和临床实践中的新型疗法,通过修复受损组织或替换身体缺陷细胞,在多种疾病治疗中发挥着越来越重要的作用。但对细胞治疗产品治疗疾病的机制和细胞移植后的宿主体内的分布和迁移情况并不非常清楚。细胞治疗产品的组织分布和存续时间是影响其有效性和安全性的重要因素,需进行动态观察。目前可选择的示踪技术包括影像学、聚合酶链反应(PCR)和免疫组织化学等技术。PCR技术和免疫组织化学技术的缺点是需要在细胞移植后处死动物,取出相应组织进行检测,存在一定的局限性。随着影像学技术的发展,正电子发射计算机断层成像、单光子发射计算机断层成像、磁共振成像和光学成像等手段为细胞移植后无创和实时评估移植细胞的分布、迁移和归巢提供了新选择。近年来,已有大量关于细胞非临床无创性示踪方法的研究。本综述主要对细胞非临床活体示踪方法的研究进展进行综述,从而为细胞治疗产品的组织分布、迁移和归巢研究提供参考。 展开更多

关键词 细胞治疗 细胞标记 活体示踪 细胞分布 细胞迁移

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基于4%中性甲醛固定肝组织的大鼠肝微核实验方法的建立与验证 被引量：1

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作者 赵田田 何伟伟 +3 位作者 周长慧 赵泽浩 杨紫轩 常艳 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2024年第6期436-444,共9页

目的建立并验证基于4%中性甲醛固定肝组织制备肝细胞的大鼠肝微核实验(LMNT)方法(甲醛固定-LMNT法)。方法(1)SD大鼠分为雌性和雄性组,然后分别随机分为溶剂对照组和肝微核阳性化合物N-亚硝基二乙胺(DEN)12.5 mg·kg^(-1)组,每组5只... 目的建立并验证基于4%中性甲醛固定肝组织制备肝细胞的大鼠肝微核实验(LMNT)方法(甲醛固定-LMNT法)。方法(1)SD大鼠分为雌性和雄性组,然后分别随机分为溶剂对照组和肝微核阳性化合物N-亚硝基二乙胺(DEN)12.5 mg·kg^(-1)组,每组5只,分别ig给予生理盐水和DEN,每天1次,连续14 d后取肝组织,同时用胶原酶消化-LMNT法和甲醛固定-LMNT法检测微核化肝细胞数量和处于有丝分裂期肝细胞数,分别计算肝细胞微核率和有丝分裂指数,肝细胞微核率>0.07%判定为阳性结果。(2)雄性SD大鼠分为喹啉(30,60和120 mg·kg^(-1))组、N-亚硝基吡咯烷(NPYR,25,50和100 mg·kg^(-1))组、各自溶剂对照组(NPYR,去离子水;喹啉,玉米油)及阳性对照DEN(12.5 mg·kg^(-1))组,每组5~6只,连续ig 15 d。每日记录体重,实验结束取肝记录肝总重,计算肝系数。自动生化分析仪检测肝功能相关血清生化指标谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性和血清总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)的水平。采用胶原酶消化-LMNT法和甲醛固定-LMNT法测定肝细胞微核率,用外周血微核实验和肝彗星实验评价喹啉和NPYR遗传毒性。结果(1)与各自溶剂对照组的肝细胞微核率(0.069%和0.030%)相比,甲醛固定-LMNT法测得的DEN组雄性大鼠肝细胞微核率为1.10%,雌性大鼠为0.82%,均显著升高(P<0.05);与各自溶剂对照组(0.060%和0.030%)相比,胶原酶消化法-LMNT法测得的DEN组雄性大鼠肝细胞微核率为1.45%,雌性大鼠为0.46%,均显著升高(P<0.05),判定为阳性。2种方法中雄性大鼠的肝细胞微核率均显著高于雌性(P<0.05)。与各自溶剂对照组相比,2种方法测得的DEN组雄性和雌性大鼠肝细胞有丝分裂指数均无明显差异。(2)与溶剂对照组相比,NPYR 50和100 mg·kg^(-1)组大鼠体重在ig第7~14天显著降低(P<0.01),DEN组在ig第8~14天显著降低(P<0.01);喹啉120 mg·kg^(-1)组大鼠在ig第4~14天显著降低(P<0.01),DEN组在ig第10~14天显著降低(P<0.05)。与溶剂对照组相比,NPYR 100 mg·kg^(-1)组(P<0.01)和DEN组(P<0.05)的肝重和肝系数均显著降低;喹啉60和120 mg·kg^(-1)组肝重(P<0.01)和肝系数(P<0.05)均显著增加。与溶剂对照组相比,DEN组大鼠血清T-BIL水平显著升高(P<0.01),NPYR 100 mg·kg^(-1)组GPT、GOT活性和D-BIL、T-BIL水平均显著升高(P<0.01),NPYR 25,50 mg·kg^(-1)和喹啉各剂量组则均无显著差异。甲醛固定-LMNT法测得的NPYR组肝细胞微核率较胶原酶消化-LMNT法略高,均判定为阳性;与溶剂对照组相比,2种方法测得的NPYR组肝细胞微核率均显著增加(P<0.05),喹啉组结果相当,均判定为阳性;2种方法测得的喹啉组肝细胞微核率均显著增加(P<0.05)。2种方法测得的NPYR和喹啉组肝细胞微核率相关性较好(R2分别为0.8614和0.9279)。NPYR组外周血微核实验为阴性,彗星实验结果为阳性;喹啉组外周血微核实验和彗星实验结果均为阴性。结论初步建立并验证了甲醛固定-LMNT法,且该方法检测肝致癌物的灵敏度与胶原酶-LMNT法相近。 展开更多

关键词 肝微核实验 甲醛固定 胶原酶消化

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背根神经节在药物神经毒性体外评价中的应用 被引量：4

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作者 王美婷 赵琪 +2 位作者 张艺哲 邢红艳 汪溪洁 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2021年第4期305-311,共7页

背根神经节神经元是感觉信息的初级传入神经元,可接收周围感觉神经末梢传出的信号,整合后将其传递至脊髓。抗肿瘤药和麻醉药等可损害背根神经节神经元的胞体和轴突,导致感觉信息传导异常,从而产生神经毒性。背根神经节体外模型来源广泛... 背根神经节神经元是感觉信息的初级传入神经元,可接收周围感觉神经末梢传出的信号,整合后将其传递至脊髓。抗肿瘤药和麻醉药等可损害背根神经节神经元的胞体和轴突,导致感觉信息传导异常,从而产生神经毒性。背根神经节体外模型来源广泛,来源于人多能干细胞和成纤维细胞的背根神经节神经元是近年的研究热点,且在多种药物的神经毒性评价、高通量筛选和机制研究中具有广阔的应用前景。本文对背根神经节的体外模型来源及其在药物神经毒性体外评价中的应用予以综述。 展开更多

关键词 神经毒性 背根神经节 感觉神经元 人多能干细胞 抗肿瘤药

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3D肝细胞遗传毒性检测方法的建立 被引量：1

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作者 王敬亭 赵田田 +5 位作者 赵泽浩 周长慧 李嫚琪 杨紫轩 何伟伟 常艳 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期949-955,共7页

目的采用人源化肝细胞HepG2细胞与3D细胞培养技术在体外建立3D肝细胞模型,用不同的模式化合物分别建立3D肝细胞微核组学试验方法(cytokinesis-block micronucleus cytome,CBMN-cyt)及3D肝细胞彗星试验方法。方法采用无支架培养方式,选... 目的采用人源化肝细胞HepG2细胞与3D细胞培养技术在体外建立3D肝细胞模型,用不同的模式化合物分别建立3D肝细胞微核组学试验方法(cytokinesis-block micronucleus cytome,CBMN-cyt)及3D肝细胞彗星试验方法。方法采用无支架培养方式,选取球体外观、球体内部细胞存活率、Ⅰ和Ⅱ相代谢酶基因表达及肝脏特异性生物标志物表达作为检测指标评估球体生长特性,确定3D肝细胞球体最佳培养条件,并探索3D肝细胞模型用于体外微核组学试验和体外彗星试验的适用性。结果3D肝细胞模型的最佳培养条件为5×10^(3)个细胞/20μL/滴接种,培养7 d。采用体内外微核阳性化合物丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)初步建立了3D肝细胞微核组学方法,可成功检测出MMC的遗传毒性和细胞毒性;与2D肝细胞模型结果对比,3D肝细胞模型在检测微核和核芽时具有更高的灵敏度。采用已知体内外彗星试验阳性化合物甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)建立了3D肝细胞彗星试验方法,MMS在低细胞毒性下可使3D肝细胞的尾DNA%显著性增加,且3D肝细胞模型对MMS遗传毒性检测灵敏度高于2D细胞。结论建立的3D肝细胞模型操作简单,成本低廉,并在体外微核试验和彗星试验中表现出较好的灵敏度和特异性,提示3D肝细胞遗传毒性试验方法在早期药物的遗传毒性筛选和追加试验研究中具有良好的应用前景。 展开更多

关键词 遗传毒性 3D培养 肝细胞 彗星试验 微核细胞组学试验 HEPG2细胞

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Long Evans大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型的特征及其造模前后谷氨酸的含量

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作者 熊亚妮 孟永 +3 位作者 钱仪敏 张鹏 张慧 李华 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2023年第6期54-61,共8页

目的观察Long Evans大鼠视网膜缺血再灌注(retinal ischemia reperfusion,RIR)损伤后视网膜的功能、结构及谷氨酸含量的变化,为视网膜的损伤及可能保护机制研究提供参考。方法随机选取30只成年SPF级Long Evans大鼠,对其左眼前房持续60 ... 目的观察Long Evans大鼠视网膜缺血再灌注(retinal ischemia reperfusion,RIR)损伤后视网膜的功能、结构及谷氨酸含量的变化,为视网膜的损伤及可能保护机制研究提供参考。方法随机选取30只成年SPF级Long Evans大鼠,对其左眼前房持续60 min灌注高压生理盐水(132 mmHg),构建RIR损伤模型,右侧眼不处理作为自身对照。在造模后1、3、7和14 d,利用闪光全视网膜电图(flash electroretinogram,f-ERG)检测视网膜电生理功能的变化情况;在造模前及造模后3、7、14 d,利用光学相干断层技术(optical coherence tomography,OCT)测量视网膜厚度,眼底成像观察眼底血管的变化情况;于造模后14 d处死大鼠,进行石蜡包埋、苏木精伊红(hematoxylin eosin,HE)染色和缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)荧光染色观察视网膜形态结构、细胞凋亡及分布情况,ELISA检测视网膜谷氨酸的含量。结果与对照眼相比,造模眼从第1天开始视网膜电图b波振幅极显著下降(P<0.01),潜伏期极显著延迟(P<0.01);OCT显示从第3天开始视网膜神经节细胞复合体(retinal ganglion cell complex,GCC)厚度极显著变薄(P<0.01),从第7天开始全层视网膜厚度极显著变薄(P<0.01),且都随着时间延长越来越薄(P<0.05);眼底照片显示视网膜从第3天开始出现明显的缺血,一直到第14天都没有恢复到正常水平;第14天HE染色切片结果显示视网膜萎缩,内层明显变薄,视网膜神经节细胞(ganglion cells,RGCs)减少;TUNEL荧光染色结果显示视网膜各层出现明显的细胞凋亡;ELISA结果显示造模后视网膜谷氨酸含量增加(P<0.05)。结论Long Evans大鼠RIR损伤引起视觉电生理功能严重损伤,视网膜萎缩,尤其GCC厚度减少最明显,且随着时间延长损伤加剧,不可逆转,RGCs凋亡,眼底血管缺血,视网膜谷氨酸含量增加,为视网膜损伤类疾病的研究提供良好的动物模型。 展开更多

关键词 Long Evans大鼠 RIR损伤 视网膜 谷氨酸 动物模型

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液相色谱-串联质谱法测定SD大鼠全血中新型亲环蛋白D抑制剂RN-0001浓度

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作者 赵磊 孙丽华 +1 位作者 俞巧玲 邱云良 《分析科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期377-382,共6页

建立了液相色谱-串联质谱法测定新型亲环蛋白D抑制剂RN-0001在SD大鼠全血中的浓度。样品前处理采用简单的蛋白沉淀法,色谱分离在Gemini C18110,色谱柱(50 mm×2 mm,5μm)上进行,以含10 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸的水溶液作为流动相A,... 建立了液相色谱-串联质谱法测定新型亲环蛋白D抑制剂RN-0001在SD大鼠全血中的浓度。样品前处理采用简单的蛋白沉淀法,色谱分离在Gemini C18110,色谱柱(50 mm×2 mm,5μm)上进行,以含10 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸的水溶液作为流动相A,含0.1%甲酸的甲醇溶液作为流动相B,在0.8 mL/min流速下梯度洗脱。待测物RN-0001和内标环孢菌素A的检测采用正离子电喷雾多反应监测模式,其检测离子对分别为m/z 645.4/156.2和m/z 601.8/156.1。RN-0001在30.0 ng/mL~30.0μg/mL浓度范围内线性关系良好(r 2>0.9961),定量下限为30.0 ng/mL,批内和批间的精密度小于5.2%,批内和批间准确度在-3.6%~6.7%之间。RN-0001基质样品在室温放置18 h,-80℃冰箱放置40天以及经过5次冻融循环后均稳定。SD大鼠尾静脉注射3 mg/kg的RN-0001注射液进行药代动力学研究,RN-0001的半衰期t 1/2为3.53 h,峰浓度C 0为9370 ng/mL,血药浓度-时间曲线下面积AUC 0-24 h为5300 h·ng/mL。结果表明,所建方法适用于RN-0001在SD大鼠体内的药代动力学研究。 展开更多

关键词 亲环蛋白D抑制剂 急性肾损伤 液相色谱-串联质谱 方法学验证

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一种改良的大鼠颈静脉自主给药插管及其应用

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作者 李贝贝 张欢 +4 位作者 陆思远 刘小珍 王舒哲 刘永涛 邱云良 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2020年第6期113-120,共8页

目的介绍一种改良的大鼠颈静脉插管制作方法和颈静脉插管手术方法,并应用于一项大鼠自主给药实验研究中,评估该插管设计的使用寿命和应用效果。方法对29只已完成食物训练的雄性SD大鼠用改良的插管进行颈静脉插管手术,进行丙泊酚和可卡... 目的介绍一种改良的大鼠颈静脉插管制作方法和颈静脉插管手术方法,并应用于一项大鼠自主给药实验研究中,评估该插管设计的使用寿命和应用效果。方法对29只已完成食物训练的雄性SD大鼠用改良的插管进行颈静脉插管手术,进行丙泊酚和可卡因的自主给药模型建立,分析术后5个月的动物淘汰情况。结果丙泊酚自主给药模型和可卡因自主给药模型均建立成功,术后动物淘汰原因主要有濒死、堵管、漏液,术后第1~5个月,每个月与插管直接相关的淘汰率分别为7%、7%、10%、31%和11%,在月淘汰率在10%以内尚能接受的情况下,该插管组件的使用寿命预计至少3个月,部分插管使用寿命能够长达5个月甚至可能5个月以上。动物濒死的原因与肝肾严重损伤、电解质紊乱和体内炎症有关。结论改良的用于大鼠颈静脉自主给药的插管有诸多优点,本文所设计插管组件的插管大鼠最佳使用寿命可长达3个月,能够满足自主给药实验的基本需求,故应用效果良好,可推广使用。 展开更多

关键词 依赖性 颈静脉插管 自主给药

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