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HPLC法测定tremor大鼠脑组织中谷氨酸和GABA含量 被引量:19
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作者 俞军龄 陈再兴 +6 位作者 毛小元 孟秀君 郭凤 刘睿 吴坤灿 谢妮 蔡际群 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1530-1533,共4页
目的建立测定tremor大鼠(tm)脑内海马组织中GLU及GABA浓度的高效液相色谱(HPLC)方法。方法冰上剥离13wk的tm/Wistar大鼠海马组织,低温匀浆处理,利用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生HPLC法结合荧光检测器测定GLU和GABA的含量。0.1mol·L-1... 目的建立测定tremor大鼠(tm)脑内海马组织中GLU及GABA浓度的高效液相色谱(HPLC)方法。方法冰上剥离13wk的tm/Wistar大鼠海马组织,低温匀浆处理,利用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生HPLC法结合荧光检测器测定GLU和GABA的含量。0.1mol·L-1醋酸钾和甲醇进行二元梯度洗脱,峰面积定量。结果GLU的线性方程为Y^=1E+06X(r2=0.9937),线性范围为0.15~5.88mg·L-1,具有良好的线性关系,在0.74、1.47、3.68mg.L-13个浓度下样本回收率分别为97.7%、98.9%、100.5%;样品中GLU日内变异系数为3.8%,隔日测定后,日间变异系数为5.9%;GABA的线性方程为Y^=4E+06X(r2=0.998),线性范围为0.10~2.15mg·L-1,具有良好的线性关系,在0.2、0.5、1.0mg·L-13个浓度下样本回收率分别为98.3%、101.0%、102.7%;样品GABA日内变异系数为2.3%,隔日测定后,日间变异系数为3.9%。结论该方法较简便、快速且干扰相对较小,满足测定要求,可用于氨基酸的含量测定研究。 展开更多
关键词 谷氨酸 Γ-氨基丁酸 OPA柱前衍生化 反相高效液相色谱法 tremor大鼠 WISTAR大鼠 癫痫
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TTC染色评价豚鼠离体心脏缺血/再灌注损伤梗死面积的适宜观察时间及计算方法 被引量:13
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作者 王燕 胡慧媛 +6 位作者 赵美眯 闵冬雨 聂志伟 孙雪菲 赵金生 印丹丹 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期160-164,共5页
目的探索氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法评价豚鼠离体心脏缺血/再灌注损伤梗死面积的适宜观察时间及计算方法。方法将11只豚鼠离体心脏分为2组:对照组(control组,n=5)和缺血30 min再灌注60 min组(I30R60组,n=6)。Langendorff灌流后垂直心... 目的探索氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法评价豚鼠离体心脏缺血/再灌注损伤梗死面积的适宜观察时间及计算方法。方法将11只豚鼠离体心脏分为2组:对照组(control组,n=5)和缺血30 min再灌注60 min组(I30R60组,n=6)。Langendorff灌流后垂直心脏长轴将心脏横切成5片,弃去心耳片后,由心耳往心尖方向依次记为第1片、第2片、第3片、第4片并进行TTC染色,分别于染色后4个时间点(1、2、3、4周)对4个横切片进行逐个观察,并通过统计前2片、前3片和前4片的方法计算梗死面积百分比。结果与control组比较,I30R60组在第1周观察时第1至第4横切片梗死面积百分比均显著增加(P<0.05);第2周观察时,第1片无明显梗死,其余3个横切片与control组比较可见明显梗死区域(P<0.05);第3周观察时,4个心脏横切片梗死面积与control组比较无统计学差异(P>0.05);第4周观察时,仅第4片与control组比较具有统计学差异(P<0.05)。在计算梗死面积百分比方法中,与control组比较,I30R60组采用前2片、前3片和前4片进行计算,在第1周和第2周观察梗死面积具有统计学差异(P<0.05),在第3周、第4周观察均无统计学差异(P>0.05)。结论用TTC染色法评价豚鼠离体心脏缺血/再灌注损伤时,单片及多片心脏横切片评估梗死程度染色后第1周及第2周内观察为宜。 展开更多
关键词 TTC染色 缺血 再灌注 梗死面积 观察时间
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无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中延迟整流钾电流的变化 被引量:4
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作者 郭凤 孙威 +6 位作者 姚阳 高青华 闵冬雨 封瑞 胡慧媛 蔡际群 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期193-195,共3页
目的利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测延迟整流钾电流的变化。方法采用新生24 h内Wistar大鼠,分离海马神经元进行原代培养。体外培养至12~16 d时,无镁细胞外液处理神经元3 h并恢复正常细胞外液,应用全细... 目的利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测延迟整流钾电流的变化。方法采用新生24 h内Wistar大鼠,分离海马神经元进行原代培养。体外培养至12~16 d时,无镁细胞外液处理神经元3 h并恢复正常细胞外液,应用全细胞膜片钳技术记录神经元的放电情况及延迟整流钾电流。结果无镁处理后的神经元存在自发的"癫痫样"放电;无镁诱导可使神经元延迟整流钾电流增大。结论延迟整流钾电流增大可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放电的基础病理机制相关。 展开更多
关键词 海马 膜片钳 癫痫放电 延迟整流钾电流
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体外重组CaV1.2不同蛋白片段纯化及其与CaM相互作用的研究 被引量:4
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作者 何桂林 邵冬雪 +4 位作者 印丹丹 胡慧媛 郭凤 王红梅 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期773-776,共4页
目的纯化CaV1.2不同蛋白片段并研究其与CaM的相互作用。方法质粒转化、筛选得到转化成功BL21菌株,利用IPTG诱导GST钙通道融合蛋白表达,Glutathione-Sepharose 4B beads纯化钙通道不同蛋白片段;采用GST pull-down assay实验研究钙通道蛋... 目的纯化CaV1.2不同蛋白片段并研究其与CaM的相互作用。方法质粒转化、筛选得到转化成功BL21菌株,利用IPTG诱导GST钙通道融合蛋白表达,Glutathione-Sepharose 4B beads纯化钙通道不同蛋白片段;采用GST pull-down assay实验研究钙通道蛋白不同片段与CaM以及突变体的相互作用。结果 SDS-PAGE结果显示成功纯化获得钙通道不同蛋白片段;GST pull-down assay结果显示CT1可与CaM及突变体结合,且GST-CT1与野生型CaM结合量显著多于与突变体CaM结合量。结论成功纯化CaV1.2钙通道蛋白片段并顺利完成GST pull-down assay实验,为深入研究蛋白相互作用或发现新的蛋白相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 GSTpull-downassay CaV1.2 CAM 融合蛋白
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变性再复性方法提取高纯度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鉴定 被引量:3
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作者 孙宇 封瑞 +2 位作者 孙威 胡慧媛 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期777-780,共4页
目的探寻诱导谷胱甘肽转移酶(GST)与Cav1.2钙通道片段CT1重组的易形成包涵体的大分子融合蛋白的提取与纯化的方法。方法在E.coli BL21中转化入p GEX-6p-3/CT1重组质粒并诱导表达,采用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER分离纯... 目的探寻诱导谷胱甘肽转移酶(GST)与Cav1.2钙通道片段CT1重组的易形成包涵体的大分子融合蛋白的提取与纯化的方法。方法在E.coli BL21中转化入p GEX-6p-3/CT1重组质粒并诱导表达,采用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER分离纯化GST-CT1融合蛋白,用Pull down assay方法鉴定GST-CT1融合蛋白及其生物活性。结果应用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER能够分离得到高纯度的易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白,且分离纯化的GST-CT1融合蛋白具有与钙调蛋白结合的生物活性。结论操作简易的GST包涵体变性复性法能够针对易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白进行分离和纯化,且得到的蛋白具有生物学活性。 展开更多
关键词 包涵体 变性再复性 钙离子通道
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神经肽Y及其Y1受体在遗传性癫痫大鼠脑内的表达及意义 被引量:1
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作者 徐晓雪 郭凤 +4 位作者 王千慧 张朝东 杨军 赵久晗 蔡际群 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期794-797,801,共5页
目的探讨遗传性癫痫大鼠(TRM)海马和颞叶皮质中神经肽Y(NPY)及其Y1受体(Y1R)的表达和分布。方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测NPY和Y1R m RNA表达。ELISA试剂盒法检测TRM和Wistar大鼠海马和颞叶皮质中NPY浓度。Western blot检测Y1R蛋... 目的探讨遗传性癫痫大鼠(TRM)海马和颞叶皮质中神经肽Y(NPY)及其Y1受体(Y1R)的表达和分布。方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测NPY和Y1R m RNA表达。ELISA试剂盒法检测TRM和Wistar大鼠海马和颞叶皮质中NPY浓度。Western blot检测Y1R蛋白表达。免疫荧光双标记法分析TRM及Wistar大鼠海马CA1、CA3和DG区以及颞叶皮质中NPY与Y1R的分布和共定位。结果 ELISA和RT-PCR结果均显示,TRM海马和颞叶皮质中NPY表达明显上调,与Wistar大鼠比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果证实,TRM海马中Y1R蛋白表达明显低于Wistar大鼠,而在颞叶皮质中显著高于Wistar大鼠。免疫荧光分析发现NPY与Y1R在TRM海马CA1、CA3区神经元细胞和DG区颗粒细胞以及颞叶皮质神经元细胞中分布广泛,并存在共定位且主要定位在细胞膜上。结论在TRM海马和颞叶皮质中,NPY及其Y1R表达出现异常变化,而这种异常表达可能与TRM癫痫发生机制有关。 展开更多
关键词 癫痫 神经肽Y Y1受体 亚型 海马 颞叶皮质
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钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备
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作者 邵冬雪 孙嘉瑶 +7 位作者 杜逸 李墨 唐子鉴 于佳慧 胡慧媛 孙雪菲 孙胜男 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期877-882,共6页
目的构建钙调蛋白(Ca M)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,Clobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法将上述c DNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态... 目的构建钙调蛋白(Ca M)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,Clobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法将上述c DNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav1.2型钙通道结合并可恢复已"rundown"心肌细胞膜钙通道的活性。结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究Ca M的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 钙调蛋白 N末端片段 C末端片段 突变体 pull-down 膜片钳
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大鼠心室肌细胞单通道钙电流的记录及其电生理学特性分析
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作者 刘书源 刘雅茹 +4 位作者 高青华 赵美眯 赵金生 孙雪菲 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期197-200,共4页
目的分离大鼠心室肌细胞,记录大鼠心室肌细胞的单通道钙电流,并分析其基本电生理学性质。方法胶原酶法分离大鼠心室肌细胞;应用膜片钳技术细胞贴附式和内膜向外式记录L-型钙通道的电流,并用pClamp10分析软件进行分析。结果分离得到大鼠... 目的分离大鼠心室肌细胞,记录大鼠心室肌细胞的单通道钙电流,并分析其基本电生理学性质。方法胶原酶法分离大鼠心室肌细胞;应用膜片钳技术细胞贴附式和内膜向外式记录L-型钙通道的电流,并用pClamp10分析软件进行分析。结果分离得到大鼠心室肌细胞,细胞存活形态良好,呈杆状或柱状,具有清晰的横纹。记录到的L-型钙通道单通道电流,平均电流幅度为(1.13±0.01)pA,电导为19 pS,平均开放时间常数为(1.35±0.03)ms,平均关闭时间常数为(46.75±10.04)ms。此外,还记录到L-型钙通道的Run-down现象。结论本实验分离得到的大鼠心室肌细胞适用于膜片钳单通道记录模式;记录到的L-型钙通道的基本电生理学性质与文献报道相符。 展开更多
关键词 大鼠心室肌细胞 L-型钙通道 膜片钳技术 单通道记录
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Cav1.2钙离子通道三维结构的同源建模及其应用 被引量:4
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作者 雷明 苏敬阳 +4 位作者 李卓 晏珊 孙雪菲 朱彤 郝丽英 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期90-94,共5页
目的构建心肌Cav1.2钙离子通道三维结构模型,检验模型的准确性与可靠性。方法利用SWISS-MODEL同源建模服务器,对豚鼠心肌细胞Cav1.2通道α1亚基进行同源建模,建模结果提交至加州大学蛋白质结构在线检测服务器进行检测评估,并对结构模型... 目的构建心肌Cav1.2钙离子通道三维结构模型,检验模型的准确性与可靠性。方法利用SWISS-MODEL同源建模服务器,对豚鼠心肌细胞Cav1.2通道α1亚基进行同源建模,建模结果提交至加州大学蛋白质结构在线检测服务器进行检测评估,并对结构模型进行打分。利用MOE软件分子对接程序模拟阻断剂或药物与Cav1.2通道模型的结合,进一步验证通道模型的准确性与可靠性。结果在SWISS-MODEL服务器上搜寻到的模板序列Cav1.1α1S与目标序列Cav1.2α1C均为L型钙通道,序列比对结果显示其同源性高达71.5%,选择自动模式(automated mode)进行同源建模。L型钙通道阻断剂维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓能结合到Cav1.2通道三维结构模型的特定区域,而钠通道特异性阻断剂河豚毒素并未与该模型相结合,中药有效成份白花前胡甲素和小檗碱与该模型也有一定的结合。结论成功构建了心肌Cav1.2钙离子通道三维结构模型,为后续研究提供了可靠样本,也为同源建模在研究离子通道三维结构预测中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 离子通道 三维结构 同源建模 MOE软件 L型钙通道阻断剂 分子对接
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钙调蛋白及其突变体与电压门控钠离子通道1.2异亮氨酸-谷氨酰胺基序的结合作用
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作者 宛昱君 刘君妍 +6 位作者 王妤婷 成小雨 沙莎 贾婉莹 胡德邻 李昕宇 郭凤 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期71-75,共5页
目的:探讨在不同钙离子浓度下电压门控钠离子通道(NaV)1.2与钙调蛋白(CaM)的结合,并分析CaM的钙离子结合位点突变后与NaV1.2结合能力的变化。方法:应用PCR技术构建NaV1.2蛋白片段异亮氨酸-谷胺酰胺(IQ)基序的cDNA,采用QIAGEN点突变技术... 目的:探讨在不同钙离子浓度下电压门控钠离子通道(NaV)1.2与钙调蛋白(CaM)的结合,并分析CaM的钙离子结合位点突变后与NaV1.2结合能力的变化。方法:应用PCR技术构建NaV1.2蛋白片段异亮氨酸-谷胺酰胺(IQ)基序的cDNA,采用QIAGEN点突变技术构建CaM突变体(CaM12、CaM34、CaM1234),应用牵出(pull-down)试验技术检测有钙(100 nmol/L钙离子浓度)和无钙条件下NaV1.2 IQ与CaM及其突变体(CaM12、CaM34、CaM1234)的结合情况。结果:CaM与NaV1.2 IQ在无钙和有钙情况下均可互相结合,而单独重组谷胱甘肽-S-转移酶(GST)不具有与CaM结合的能力。无钙条件下CaM与NaV1.2 IQ的结合量大于有钙条件下两者的结合量(P<0.05);无钙条件下,CaM野生型与NaV1.2 IQ结合量大于CaM突变体与NaV1.2 IQ的结合量,其中CaM1234的结合能力在三个突变体中最弱(P<0.05)。结论:CaM及其突变体对NaV1.2 IQ的结合具有钙离子依赖性,这一CaM调控NaV1.2新机制为离子通道疾病研究提供了一定依据。 展开更多
关键词 钙调蛋白 电压门控钠通道 DNA 环状/分析 氨基酸序列 突变 异亮氨酸 钙/代谢
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初级纤毛在神经系统中的作用与机制
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作者 郑锦珍 赵洪泽 郭凤 《生理科学进展》 CAS 2022年第5期390-395,共6页
初级纤毛是一种从细胞体向细胞外突起的毛发状结构,广泛存在于神经系统中,近年来的研究认为初级纤毛在神经系统疾病中发挥关键作用。在神经系统的生理条件下,初级纤毛调节细胞周期进程,并参与多种细胞信号通路的转导;在某些病理条件下,... 初级纤毛是一种从细胞体向细胞外突起的毛发状结构,广泛存在于神经系统中,近年来的研究认为初级纤毛在神经系统疾病中发挥关键作用。在神经系统的生理条件下,初级纤毛调节细胞周期进程,并参与多种细胞信号通路的转导;在某些病理条件下,初级纤毛结构和功能突变,引起信号转导障碍,促进神经系统疾病发展,加重疾病症状。本综述主要通过探究初级纤毛在神经系统生理和病理中的作用与机制,提出其可成为神经精神系统疾病药物治疗的新靶点。 展开更多
关键词 初级纤毛 细胞周期 信号转导 神经系统
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