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ERMAP改善MOG特异性TCR转基因小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎
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作者 朱婕 宋雯茜 +4 位作者 陈柯竹 李远迪 高杰 胡蓉 苏敏 《中国免疫学杂志》 北大核心 2025年第6期1344-1349,共6页
目的:利用MOG特异性TCR转基因小鼠(2D2TCR转基因小鼠)建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型,探讨外源性ERMAP对MOG_(35-55)诱导的2D2TCR转基因小鼠脾脏中T细胞的影响。方法:两组2D2TCR转基因小鼠(对照组使用Control-Ig治疗,实验组使用... 目的:利用MOG特异性TCR转基因小鼠(2D2TCR转基因小鼠)建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型,探讨外源性ERMAP对MOG_(35-55)诱导的2D2TCR转基因小鼠脾脏中T细胞的影响。方法:两组2D2TCR转基因小鼠(对照组使用Control-Ig治疗,实验组使用ERMAP-Ig融合蛋白治疗)建立EAE模型,每组9只。根据每日临床评分(DAI)、HE、LFB染色结果评估MOG_(35-55)诱导的小鼠EAE脊髓损伤严重程度;流式细胞术检测脾脏内自身反应性T细胞(CD4^(+)Vα3.2^(+)Vβ11^(+))、T细胞增殖活化指标CD69(CD4^(+)Vα3.2^(+)Vβ11^(+)CD69^(+))和Ki67(CD4^(+)Vα3.2^(+)Vβ11^(+)Ki67)、Treg(CD4^(+)Vα3.2^(+)Vβ11^(+)CD25+Foxp3+)以及Th17细胞(CD4^(+)Vα3.2^(+)Vβ11^(+)IL-17A^(+));qRT-PCR检测脊髓组织IL-17A、IL-6、IFN-γ、TGF-β表达。结果:MOG_(35-55)诱导的2D2TCR转基因小鼠EAE模型中,ERMAP-Ig融合蛋白治疗组脊髓出现较轻的炎症浸润和脱髓鞘,脾脏中自身反应T细胞比例减少,T细胞活化及增殖比例降低,Treg比例增加,抑制Th17细胞分化,脊髓中炎症细胞聚集及细胞因子产生更少,抗炎因子表达增加。结论:ERMAP可能通过抑制T细胞增殖活化、促进Treg生成参与2D2TCR转基因小鼠EAE发生发展。 展开更多
关键词 红细胞膜相关蛋白 自身反应性T细胞 2D2TCR 实验性自身免疫性脑脊髓炎
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人脐带间充质干细胞对T细胞活化介导的肺动脉平滑肌细胞增殖抑制及机制研究
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作者 吴西军 刘庆 +2 位作者 刘俊峰 杨小燕 何志旭 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第22期2174-2180,共7页
目的阐释人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hu-MSCs)抑制T淋巴细胞活化介导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖的作用及可能的调节机制。方法复苏并培养hu-MSCs和大... 目的阐释人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hu-MSCs)抑制T淋巴细胞活化介导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖的作用及可能的调节机制。方法复苏并培养hu-MSCs和大鼠来源的PASMCs、T细胞,将实验分为PASMCs对照组、T细胞刺激组(PASMCs+T淋巴细胞)、MSC干预组(PASMCs+T淋巴细胞+MSC)、英夫利西单抗干预组(PASMCs+T淋巴细胞+英夫利西单抗)、TNF-α刺激组(PASMCs+T淋巴细胞+MSC+TNF-α)。通过荧光分光光度计、RT-qPCR、倒置荧光显微镜观察等方法研究钙调磷酸酶、T淋巴细胞核因子的变化。结果 T淋巴细胞刺激组TNF-α浓度明显升高(P<0.01);MSCs与英夫利西单抗均能明显降低其TNF-α浓度(P<0.01)。与单纯PASMCs对照组比较,T淋巴细胞刺激组PASMCs的增殖能力明显增强(P<0.01),胞浆中游离钙离子的浓度明显升高(P<0.01),胞内CaN的表达(P<0.01)和活性(P<0.01)均显著上调,NFATc2的表达和活性亦显著上调(P<0.01);与T淋巴细胞刺激组相比,MSCs干预组、英夫利西单抗干预组PASMCs的增殖被明显抑制(P<0.01),胞浆中游离钙离子的浓度均明显下降(P<0.01),胞内CaN的表达(P<0.01)和活性(P<0.01)均显著下调,NFATc2的表达(P<0.01)和活性亦下调;外源TNF-α可有效逆转MSC的干预作用,其作用与T淋巴细胞刺激组几乎相当。结论 hu-MSCs可以通过改变CaN、NFATc2的表达和活化状态,抑制T淋巴细胞活化,抑制炎症因子TNF-α导致的PASMCs增殖。 展开更多
关键词 间充质干细胞 肺动脉平滑肌细胞 细胞增殖 肿瘤坏死因子α 钙调磷酸酶 T淋巴细胞核因子
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基于高分辨率熔解曲线技术的CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变快速检测研究 被引量:1
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作者 陈黎 卢茜 +2 位作者 杨红兰 张鹏 何志旭 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期90-96,共7页
旨在建立一种通过高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析技术快速检测CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变的方法。采用野生型、纯合突变及杂合突变小鼠胚胎干细胞优化和完善HRM检测条件,然后应用建立的HRM方法对30个测序结果... 旨在建立一种通过高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析技术快速检测CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变的方法。采用野生型、纯合突变及杂合突变小鼠胚胎干细胞优化和完善HRM检测条件,然后应用建立的HRM方法对30个测序结果已知的CRISPR/Cas9技术编辑过的小鼠胚胎干细胞单克隆进行检测,根据熔解温度与熔解曲线的差异区分野生型、纯合突变型及杂合突变型,以验证HRM方法的可行性和准确性。结果表明,优化的HRM检测方法能够鉴别野生型、纯合突变型及杂合突变型小鼠胚胎干细胞。应用建立的HRM方法分析30个CRISPR/Cas9技术编辑过的小鼠胚胎干细胞单克隆,结果显示,14个单克隆为杂合突变型、2个单克隆为纯合突变型、14个单克隆为野生型,与测序结果一致,准确率为100%。本研究建立的高分辨率熔解曲线法能对CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变进行快速筛选,是一种灵敏、准确、简便、高通量的方法。 展开更多
关键词 高分辨率熔解曲线 CRISPR/Cas9 细胞基因突变 检测
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miR-26b调控Wnt/β-catenin信号通路促进成肝样分化MSCs迁移研究 被引量:5
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作者 吉杨丹 罗红阳 +10 位作者 王丹 王恒 杨小燕 何志旭 刘金河 汪显耀 赵锦 张丽娟 张玲敏 秦臻 许键炜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2020年第12期1850-1857,共8页
目的探讨miR-26b与Wnt/β-catenin信号通路、间充质干细胞(MSCs)不同分化状态的关系及其在MSCs向肝细胞生长因子(HGF)趋化迁移过程中的作用。方法以大鼠骨髓来源MSCs作为研究对象,用无血清诱导分化培养基分别培养0、7、14、21d,建立成... 目的探讨miR-26b与Wnt/β-catenin信号通路、间充质干细胞(MSCs)不同分化状态的关系及其在MSCs向肝细胞生长因子(HGF)趋化迁移过程中的作用。方法以大鼠骨髓来源MSCs作为研究对象,用无血清诱导分化培养基分别培养0、7、14、21d,建立成肝样分化不同阶段的MSCs分化模型,qRT-PCR检测miR-26b在不同分化状态MSCs细胞中的表达;重组腺病毒(Ad-26b)感染MSCs实现miR-26b的高表达,并以空病毒感染MSCs为对照(Ad)后,检测细胞中信号分子active-β-catenin(ABC)、p-β-catenin、β-catenin的表达量以及Wnt/β-catenin经典靶基因c-Myc、RUNX2的转录水平,明确其对MSCs铺展面积和黏着斑的影响以及通过Transwell、Dunnchamber实验,比较其对不同分化状态MSCs趋化迁移的影响。结果随着诱导分化时间的延长,MSCs的miR-26b表达呈上升趋势,14d时,miR-26b的表达至高峰,与对照组比较有统计学意义(P<0.05);Ad-26b组较Ad组ABC蛋白水平升高,p-β-catenin的蛋白水平下降,而β-catenin总蛋白无变化,Wnt/β-catenin信号下游靶基因c-Myc,RUNX2的表达上调。Ad-26b组高表达miR-26b后可促使MSCs铺展面积变小并呈现极性分布,MSCs细小黏着斑数目增加并向细胞前端周边分布。Transwell及Dunncham-ber实验表明MSCs诱导分化至7d,向HGF的趋化迁移能力高于诱导分化0、14和21d。高表达miR-26b组较Ad组细胞向HGF的趋化迁移能力较对照组增强(P<0.05)。结论miR-26b通过调节Wnt/β-catenin信号通路影响MSCs的分化和趋化迁移。 展开更多
关键词 间充质干细胞 miR-26b WNT/Β-CATENIN信号通路 成肝样分化 趋化迁移
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红系祖细胞在造血缺陷斑马鱼体内的移植 被引量:6
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作者 李志操 黄波 +5 位作者 向文碧 孙琮杰 吴西军 周艳华 何志旭 舒莉萍 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第5期84-89,共6页
目的评估红系祖细胞在先天原始造血缺陷cloche^(-/-)突变体斑马鱼体内的移植效果。方法收集绿色荧光标记红系祖细胞的转基因系zTg(gata1:EGFP)斑马鱼胚胎,制备成单细胞悬液,经流式细胞仪分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,利用显微注射... 目的评估红系祖细胞在先天原始造血缺陷cloche^(-/-)突变体斑马鱼体内的移植效果。方法收集绿色荧光标记红系祖细胞的转基因系zTg(gata1:EGFP)斑马鱼胚胎,制备成单细胞悬液,经流式细胞仪分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,利用显微注射技术将gata1^+细胞移植到42hpf的cloche^(-/-)突变体斑马鱼心脏中,采用体视荧光显微镜追踪观察移植后的红系祖细胞在cloche^(-/-)突变体斑马鱼中的表达情况。结果成功分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,并在移植后2 h可观察到携带绿色荧光的gata1^+细胞逐渐增殖扩散且16 h持续有绿色荧光表达。结论红系祖细胞有重建造血的潜力,为进一步研究红系祖细胞移植后的功能鉴定提供实验依据。 展开更多
关键词 红系祖细胞 斑马鱼 移植 cloche^-/-突变
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体外扩增的NK细胞运载溶瘤呼肠孤病毒对结直肠癌细胞的杀伤效应 被引量:6
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作者 陈晓庆 王念雪 +4 位作者 龙世棋 廖春香 刘金河 杨薇 赵星 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期492-499,共8页
目的:评价体外扩增的人NK细胞能否作为呼肠孤病毒的运载细胞并探讨其临床转化应用价值。方法:体外扩增人NK细胞,用NK细胞装载呼肠孤病毒,激光共聚焦显微镜观察呼肠孤病毒与NK细胞结合的部位。NK细胞运载呼肠孤病毒(Reo-NK)到达肿瘤细胞... 目的:评价体外扩增的人NK细胞能否作为呼肠孤病毒的运载细胞并探讨其临床转化应用价值。方法:体外扩增人NK细胞,用NK细胞装载呼肠孤病毒,激光共聚焦显微镜观察呼肠孤病毒与NK细胞结合的部位。NK细胞运载呼肠孤病毒(Reo-NK)到达肿瘤细胞后,CCK-8法检测在中和抗体的存在下病毒发挥的溶瘤作用;qPCR法检测肿瘤细胞内病毒RNA的相对表达量。CCK-8法检测Reo-NK对结直肠癌KRAS基因突变型(DLD-1)和野生型(CaCo-2、HT29)细胞株的杀伤效应,ELISA双抗体夹心法检测NK细胞释放的穿孔素水平。结果:呼肠孤病毒主要结合于NK细胞膜上,在人AB型血清的存在下体外扩增的NK细胞可将呼肠孤病毒传递到肿瘤细胞,且传递后的呼肠孤病毒仍具有显著溶瘤活性(P<0.01);同时检测到肿瘤细胞内病毒RNA的表达量显著增高(P<0.01)。与NK组相比,Reo-NK组对KRAS基因突变型和野生型结直肠癌细胞株的细胞毒作用均显著增强(P<0.05),穿孔素的释放均明显增加(P<0.05)。结论:体外扩增的人NK细胞适合作为呼肠孤病毒的运载细胞,且呼肠孤病毒能够增强NK细胞的细胞毒作用,两者联合后对结直肠癌细胞可发挥更强的杀伤作用,因而具有重要的临床转化应用价值。 展开更多
关键词 呼肠孤病毒 自然杀伤细胞 运载细胞 结直肠癌细胞
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hUC-MSCs对缺氧缺血脑损伤新生大鼠脑组织的保护作用研究 被引量:1
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作者 陈茂琼 向敏 +8 位作者 宋海良 王岚 匡梦岚 张丽娟 熊英 何志旭 许键炜 高鸿 秦臻 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第8期1226-1231,共6页
目的通过移植人脐带来源的间充质干细胞(hUC-MSCs)治疗缺氧缺血诱导的新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE),并探讨hUC-MSCs对神经细胞的保护作用及机制。方法采集足月健康新生儿脐带约10 cm,运用组织块贴壁法培养hUC-MSCs,通过感染重组携带绿... 目的通过移植人脐带来源的间充质干细胞(hUC-MSCs)治疗缺氧缺血诱导的新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE),并探讨hUC-MSCs对神经细胞的保护作用及机制。方法采集足月健康新生儿脐带约10 cm,运用组织块贴壁法培养hUC-MSCs,通过感染重组携带绿色荧光蛋白的腺病毒标记细胞;取18只新生健康7d龄SD大鼠,随机均分为对照(假手术)、模型、治疗组,其中模型组及治疗组建立新生大鼠缺氧缺血脑损伤模型,建模成功24 h后将标记的hUC-MSCs注射入治疗组左侧(损伤侧)侧脑室,各组大鼠hUC-MSCs移植治疗48 h后,检测hUC-MSCs在HIE大鼠大脑内的定植并采用TTC染色观察梗死脑组织,RT-qPCR测定海马组织中Beclin-2、Caspase-3 mRNA水平的变化,Western blot检测海马区细胞Beclin-2、Caspase-3蛋白的表达。结果对照组大鼠大脑没有形成梗死体积,模型组大鼠大脑梗死体积明显,梗死体积比为(41.67±4.17)%;治疗组大鼠经hUC-MSCs移植治疗48 h后,大脑梗死体积减小[(16.65±3.43)%],与模型组比较,差异有统计学意义;HIE建模48 h后,内源性Beclin-2、Caspase-3的mRNA以及蛋白的表达上调。hUC-MSCs移植治疗48 h后,Beclin-2、Caspase-3的mRNA以及蛋白的表达下降。结论hUC-MSCs能减小缺氧缺血损伤大鼠大脑梗死体积,对损伤大鼠有保护作用;hUC-MSCs能够减少大鼠脑细胞凋亡,下调缺氧缺血脑损伤大鼠海马区细胞凋亡相关Beclin-2、Caspase-3的mRNA以及蛋白水平。 展开更多
关键词 缺氧缺血性脑病 人脐带来源的间充质干细胞 凋亡 Beclin-2 Caspase-3
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汉防己甲素联合化疗药物在斑马鱼体内逆转多药耐药的研究 被引量:1
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作者 向文碧 李志操 +4 位作者 周栋珍 周艳华 吴西军 何志旭 舒莉萍 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2020年第5期1-6,共6页
目的探讨汉防己甲素对斑马鱼胚胎早期发育及多药耐药基因abcb4表达的影响及其机制。方法通过药物毒性实验分析汉防己甲素药液处理后斑马鱼胚胎的死亡率、孵化率、心率和畸形率情况。取斑马鱼胚胎设置分组:空白对照组、阿霉素药液处理组... 目的探讨汉防己甲素对斑马鱼胚胎早期发育及多药耐药基因abcb4表达的影响及其机制。方法通过药物毒性实验分析汉防己甲素药液处理后斑马鱼胚胎的死亡率、孵化率、心率和畸形率情况。取斑马鱼胚胎设置分组:空白对照组、阿霉素药液处理组、长春碱药液处理组、汉防己甲素药液处理组、汉防己甲素和阿霉素混合药液处理组及汉防己甲素和长春碱混合药液处理组,每组胚胎用药液处理至第5天后取50尾用于实验。通过实时荧光定量PCR检测abcb4基因的表达情况,罗丹明123实验检测胚胎的外排功能,分析耐药程度。结果低剂量汉防己甲素对斑马鱼胚胎毒性较低,高剂量汉防己甲素对胚胎孵化有抑制作用,并有致畸致死作用;实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比abcb4基因的mRNA在阿霉素和长春碱药液单独使用时表达增高,而在汉防己甲素联合阿霉素、长春碱使用时表达降低;罗丹明123实验结果显示,阿霉素和长春碱单独使用时斑马鱼体内产生耐药,而汉防己甲素联合阿霉素、长春碱使用时耐药程度降低。结论汉防己甲素对斑马鱼胚胎毒性较低,且汉防己甲素能逆转物阿霉素和长春碱的耐药作用,对提高治疗效果有重要意义。 展开更多
关键词 汉防己甲素 多药耐药 abcb4 斑马鱼
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LRG1抑制小鼠肝巨噬细胞活化从而改善代谢相关脂肪性肝病:基于增强TGF-β1信号通路 被引量:6
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作者 徐龙飞 韩晶 +5 位作者 杨喆 杨燕平 陈金慧 吴西军 王琪 洪艳 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1164-1171,共8页
目的探讨肝细胞来源的富含亮氨酸α-2糖蛋白1(LRG1)对M1型肝巨噬细胞活化的影响。方法BALB/c小鼠通过高脂饮食(HFD)喂养16周来建立代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)模型,油酸诱导小鼠原代肝细胞发生脂肪变性,用RT-PCR和Westernblot检测肝组织... 目的探讨肝细胞来源的富含亮氨酸α-2糖蛋白1(LRG1)对M1型肝巨噬细胞活化的影响。方法BALB/c小鼠通过高脂饮食(HFD)喂养16周来建立代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)模型,油酸诱导小鼠原代肝细胞发生脂肪变性,用RT-PCR和Westernblot检测肝组织和肝细胞中LRG1的mRNA和蛋白水平的表达。将原代肝巨噬细胞分为5组,对照组、脂肪变性肝细胞来源的上清(CM)刺激组、CM+LRG1组、CM+转化生长因子-β1(TGF-β1)组、CM+TGF-β1+LRG1组,各组培养24 h后,Western bot法检测一氧化氮合酶(iNOS)蛋白水平的表达,RT-PCR法检测iNOS、趋化因子1(CXCL-1)和白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA水平的表达。MAFLD小鼠分为4组,1组作为对照(6只),其余3组经尾静脉分别注射LRG1(6只)、TGF-β1(6只)或者TGF-β1+LRG1(6只),收集肝组织,经HE染色观察肝脏病理学变化,免疫组化法观察肝组织中F4/80+细胞的分布,RT-PCR法检测肝组织iNOS、CXCL-1和IL-1β的mRNA水平的表达。结果HFD小鼠肝组织和脂肪变性的肝细胞中LRG1的mRNA和蛋白水平的表达显著降低(P<0.05)。脂肪变性肝细胞来源的CM刺激明显促进肝巨噬细胞中iNOS、CXCL-1和IL-1β的mRNA水平的表达,而TGF-β1和LRG1联合刺激时明显抑制这些分子mRNA水平的表达(P<0.05)。小鼠HFD16周后,单独注射LRG1或TGF-β1均可减少肝内脂质沉积以及肝内巨噬细胞的浸润,二者联合上述改变更加明显。同时,TGF-β1和LRG1联合刺激时也明显抑制iNOS、CXCL-1和IL-1β的mRNA水平的表达(P<0.05)。结论LRG1通过增强TGF-β1信号通路抑制肝巨噬细胞浸润,从而缓解非酒精性脂肪肝的炎性反应。 展开更多
关键词 富亮氨酸α2-糖蛋1 肝巨噬细胞 代谢相关脂肪性肝病 转化生长因子-β1 脂肪变性
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Tet1蛋白对HEK293T细胞增殖、周期及凋亡的影响
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作者 莫晶 杨红兰 +5 位作者 刘含 金皎 范安然 张鹏 周艳华 舒莉萍 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2020年第6期69-75,共7页
目的构建可诱导Tet1CD过表达的稳转细胞系,探究Tet1蛋白对细胞增殖、周期及凋亡的影响。方法构建重组质粒p TRE-Tight_Tet1CD_IRES_RFP_RPBSA_M2rtTA_Puro,然后与表达转座酶的"睡美人"质粒通过脂质体法共同转染到HEK 293T细胞... 目的构建可诱导Tet1CD过表达的稳转细胞系,探究Tet1蛋白对细胞增殖、周期及凋亡的影响。方法构建重组质粒p TRE-Tight_Tet1CD_IRES_RFP_RPBSA_M2rtTA_Puro,然后与表达转座酶的"睡美人"质粒通过脂质体法共同转染到HEK 293T细胞,通过嘌呤霉素筛选和多西环素诱导构建诱导表达型的Tet1CD稳转细胞系293T(Tet1CD)。通过Western blot检测Tet1蛋白的表达;通过DNA dot blot检测细胞基因组中5hmC的含量,通过流式细胞术检测Tet1CD蛋白对细胞周期和凋亡的影响;通过细胞计数检测Tet1CD蛋白对细胞增殖的影响。结果成功建立了可诱导Tet1CD过表达的HEK293T细胞系293T(Tet1CD);Western blot结果显示诱导后细胞内Tet1CD蛋白表达上升;DNA dot blot结果显示过表达Tet1CD蛋白细胞内5hmC含量升高;流式细胞术结果显示,Tet1CD过表达促进了细胞凋亡(P<0. 05)及增加G2时期细胞比例(P<0. 05);细胞计数结果显示,Tet1CD过表达抑制细胞增殖(P<0. 0001)。结论 Tet1蛋白可能通过促进细胞凋亡及阻滞细胞周期最终抑制细胞增殖。 展开更多
关键词 表观遗传 Tet蛋白 细胞周期 细胞凋亡 细胞增殖
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二氢杨梅素对Bloom解旋酶结构和生物学活性的影响 被引量:2
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作者 刘金河 张望明 +2 位作者 晏文涛 许键炜 葛章文 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1453-1460,共8页
目的二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY),是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗肿瘤等作用,研究DMY对Bloom解旋酶(Bloom helicase,BLM)生物学活性的影响对探索DMY的抗肿瘤机制具有重要意义。方法采用紫外光谱、圆二色谱、荧光偏振和自由磷检... 目的二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY),是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗肿瘤等作用,研究DMY对Bloom解旋酶(Bloom helicase,BLM)生物学活性的影响对探索DMY的抗肿瘤机制具有重要意义。方法采用紫外光谱、圆二色谱、荧光偏振和自由磷检测等方法和技术研究DMY对BLM解旋酶的生物学活性的影响。结果圆二色谱和紫外光谱结果显示,DMY能与BLM解旋酶结合,且有1个结合位点;在0~25μmol·L^-1浓度范围内,DMY对BLM解旋酶的二级结构的干扰能力成正相关,在25~75μmol·L^-1浓度范围内则相反。荧光偏振和自由磷检测实验显示,DMY能结合在BLM解旋酶上,进而抑制BLM解旋酶的解链活性。结论DMY能够竞争性结合于BLM解旋酶的DNA结合位点上,改变BLM解旋酶的空间结构,从而抑制BLM解旋酶与DNA的结合,进而抑制BLM解旋酶的生物学活性。 展开更多
关键词 二氢杨梅素 Bloom解旋酶 生化活性 构象 二级结构 圆二色谱 荧光偏振
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1-萘酚胚胎期暴露对斑马鱼发育的毒性作用 被引量:3
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作者 任平平 舒莉萍 +3 位作者 王一慧 莫晶 周艳华 何志旭 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第14期1321-1327,共7页
目的探讨1-萘酚(1-NAP)胚胎期暴露对斑马鱼发育的毒性作用,并对其可能的机制进行研究。方法挑选斑马鱼受精卵,在受精后24 h(hours post fertilization,hpf)进行不同浓度(0、40、80、160、200μmol/L)1-NAP暴露处理,观察并记录其处理至... 目的探讨1-萘酚(1-NAP)胚胎期暴露对斑马鱼发育的毒性作用,并对其可能的机制进行研究。方法挑选斑马鱼受精卵,在受精后24 h(hours post fertilization,hpf)进行不同浓度(0、40、80、160、200μmol/L)1-NAP暴露处理,观察并记录其处理至斑马鱼120 hpf时的畸形数和死亡数,计算畸形率、孵化率及半数致死浓度(IC50)。设置空白对照组,N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理组,1-NAP处理组,NAC预处理组,检测幼鱼体内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和总巯基(-SH)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性;通过Western blot法检测胚胎凋亡蛋白Caspase3、Bax的表达情况。结果计算出1-NAP在斑马鱼胚胎的IC50为111.31μmol/L,斑马鱼胚胎期暴露于高浓度1-萘酚(>80μmol/L)导致死亡率和畸形率明显增加,孵化率明显降低,表现出发育毒性;50μmol/L浓度1-NAP处理组ROS、MDA含量明显升高,GSH、-SH水平明显降低,抗氧化酶CAT、SOD的活性受到抑制(P<0.001);胚胎凋亡蛋白Caspase3、Bax表达量增加;NAC(0.5 mmol/L)预处理组斑马鱼胚胎的畸形率明显降低,ROS、MDA含量明显减少,GSH、-SH含量以及SOD、CAT活性有所恢复,凋亡蛋白Caspase3、Bax表达量明显降低。结论 1-萘酚胚胎期暴露对斑马鱼发育的毒性作用可能与1-萘酚诱导的氧化应激相关。 展开更多
关键词 斑马鱼 胚胎期 1-萘酚 发育毒性 氧化应激
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CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼rpl15基因对斑马鱼红系造血发育的影响 被引量:3
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作者 彭涛 周唯君 +5 位作者 刘含 赵砚驰 李化 张鹏 周艳华 舒莉萍 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期683-691,共9页
目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼rpl15基因,探讨rpl15基因对斑马鱼红系造血发育的影响。方法针对斑马鱼rpl15基因设计并制备gRNA(guide RNA),将gRNA与Cas9蛋白的混合物显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中,提取72 h胚胎基因组DNA,PCR... 目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼rpl15基因,探讨rpl15基因对斑马鱼红系造血发育的影响。方法针对斑马鱼rpl15基因设计并制备gRNA(guide RNA),将gRNA与Cas9蛋白的混合物显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中,提取72 h胚胎基因组DNA,PCR扩增出目的片段,T7E1限制性酶切法检测基因打靶情况,随后进行测序分析确定编辑效果。通过O-dianisidine染色分析血红蛋白合成情况,中性粒细胞染色分析中性粒细胞生成情况,利用Real-time PCR检测p53、mdm2、hsp70和造血相关转录因子基因的表达变化。结果成功制备了rpl15 gRNA,并筛选得到rpl15突变体。rpl15基因敲除的幼鱼出现体长缩短、尾部弯曲、头部和眼睛较小及心包水肿的表型;造血相关谱系染色结果显示rpl15突变体血红蛋白合成明显减少,但中性粒细胞生成未受影响;rpl15突变体p53和mdm2的mRNA表达均显著升高(P<0.01,P<0.05,),α-globin、gata1和hsp70的mRNA表达均显著下调(P<0.01,P<0.05,P<0.05),除红系外的造血相关转录因子的mRNA表达与对照组相比均无明显差异。结论利用CRISPR/Cas9技术成功编辑了斑马鱼rpl15基因,突变体产生了类似先天性纯红细胞再生障碍性贫血疾病的表型。同时表明p53与hsp70可能参与调控突变体表型的形成。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 rpl15基因 DBA 斑马鱼
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人红白血病斑马鱼异种模型的建立 被引量:1
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作者 王一慧 刘庆 +5 位作者 杨小燕 王念雪 王猛 舒莉萍 何志旭 吴西军 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第1期77-82,共6页
目的利用斑马鱼胚胎建立人红白血病(HEL)细胞异种移植瘤模型,提供研究血液肿瘤的体内行为和实用药物测试的模型。方法将HEL细胞分为空白组和CM-DiI组,CM-DiI组用活细胞示踪剂进行标记;取野生型斑马鱼培育繁殖,产胚后将胚胎置于28℃孵育4... 目的利用斑马鱼胚胎建立人红白血病(HEL)细胞异种移植瘤模型,提供研究血液肿瘤的体内行为和实用药物测试的模型。方法将HEL细胞分为空白组和CM-DiI组,CM-DiI组用活细胞示踪剂进行标记;取野生型斑马鱼培育繁殖,产胚后将胚胎置于28℃孵育48 h至破膜,将破膜后斑马鱼分为空白对照组、PBS实验组、HEL实验组,将CM-DiI组细胞,通过显微注射方式移植到HEL实验组斑马鱼卵黄囊中,PBS实验组注射PBS,再将三组斑马鱼置于34℃温箱培养,通过体内外增殖实验及体内荧光观察等鉴定模型是否建立成功;将鉴定成功的斑马鱼进行阿糖胞苷药物暴露,分为50、100、200 nmol/L组及模型对照组,观察各组浓度药物暴露后异种移植瘤模型中白血病细胞的增殖及迁移情况。结果 CM-Dil组与空白组HEL细胞增殖状态相近,差异无统计学意义(P>0.05);通过体内外增殖实验证实了HEL细胞在斑马鱼体内出现了增殖,而HEL实验组斑马鱼存活量相对于空白对照组和PBS实验组降低(P<0.05);三个浓度的阿糖胞苷药物暴露组相对于模型对照组细胞增殖降低(P<0.05)。结论人急性红白血病HEL细胞移植入斑马鱼胚胎后可进行增殖,且增殖活动可被阿糖胞苷干预,证实异种移植瘤模型建立成功。 展开更多
关键词 斑马鱼 急性红白血病 异种移植 人红白血病细胞 阿糖胞苷
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清肺排毒汤对LPS诱导急性肺损伤小鼠炎症的作用 被引量:6
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作者 匡梦岚 张丽娟 +4 位作者 卢攀攀 解小芬 胡光线 沈祥春 许键炜 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1462-1468,共7页
目的探讨清肺排毒汤对脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤(ALI)小鼠的抗炎作用及其机制。方法小鼠随机分为对照组、模型组、地塞米松组及清肺排毒汤低、高剂量组,除对照组外,其余各组采用气管穿刺注射LPS建立ALI模型,造模成功后给予相应药物干预... 目的探讨清肺排毒汤对脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤(ALI)小鼠的抗炎作用及其机制。方法小鼠随机分为对照组、模型组、地塞米松组及清肺排毒汤低、高剂量组,除对照组外,其余各组采用气管穿刺注射LPS建立ALI模型,造模成功后给予相应药物干预7 d。记录小鼠存活率、肺湿干重比,HE染色观察肺损伤程度,吉姆萨染色法及血液分析仪分类计数肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞,RT-qPCR法检测肺组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达,ELISA法检测小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平,Western blot法检测肺组织TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达。结果与模型组比较,清肺排毒汤高剂量组小鼠肺水肿和损伤程度,血清、BALF中炎性细胞因子和炎性细胞数量,肺组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达和肺组织TLR4、MyD88、p-NF-κB p65,p-IκBα蛋白表达均有不同程度降低(P<0.05,P<0.01)。结论清肺排毒汤可能通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制炎症因子和介质释放,减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤。 展开更多
关键词 清肺排毒汤 脂多糖 急性肺损伤 TLR4/MyD88/NF-κB信号通路 炎症
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丁酸钠、Hemin及DMSO诱导K562红系分化作用的差异 被引量:1
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作者 刘含 杨红兰 +3 位作者 莫晶 张鹏 范安然 何志旭 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第5期746-751,共6页
目的比较丁酸钠、氯化血红素(Hemin)及DMSO诱导K562红系分化作用的差异。方法检测在1.5 mmol/L丁酸钠,20μmol/L Hemin及2%DMSO处理下,K562细胞增殖、细胞周期、四甲基联苯胺(TMB)染色阳性率及CD235a表达量的变化。结果连续药物暴露120 ... 目的比较丁酸钠、氯化血红素(Hemin)及DMSO诱导K562红系分化作用的差异。方法检测在1.5 mmol/L丁酸钠,20μmol/L Hemin及2%DMSO处理下,K562细胞增殖、细胞周期、四甲基联苯胺(TMB)染色阳性率及CD235a表达量的变化。结果连续药物暴露120 h后结果显示,丁酸钠对K562细胞增殖有抑制作用,48~72 h细胞阻滞于G0/G1;96~120 h细胞阻滞于G2/M期,120 h TMB阳性率为(22.02±2.27)%。Hemin对K562细胞的增殖及细胞周期均无影响;120 h TMB阳性率为(90.83±2.69)%。DMSO处理的K562细胞其G0/G1期比例增多,但暴露时间大于72 h时,细胞增殖与对照组差异无统计学意义;120 h TMB阳性率为(1.84±0.48)%,相较于对照组阳性率(2.89±0.18)%差异无统计学意义。丁酸钠和Hemin处理120 h后血型糖蛋白A(CD235a)的表达水平较对照组和DMSO处理组升高,且2组间差异无统计学意义。DMSO处理组CD235a与对照组差异无统计学意义。结论通过综合比较红系分化诱导前后K562细胞增殖、细胞周期、TMB阳性率及CD235a表达量的变化发现,Hemin是较丁酸钠和DMSO体外诱导K562红系分化更有效的化学试剂。 展开更多
关键词 丁酸钠 氯化血红素 DMSO K562 红系分化
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Wnt/β-catenin信号通路参与化疗药物诱导的转基因斑马鱼abcb4基因的表达和耐药 被引量:2
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作者 陈露 向文碧 +4 位作者 莫晶 孙琮杰 周艳华 吴西军 何志旭 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期134-139,共6页
目的探讨斑马鱼耐药基因ATP结合盒亚家族B成员4(ABCB4)与Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路的关系。方法取野生型斑马鱼和转基因斑马鱼均设置空白对照组、阿霉素处理组、长春碱处理组、吉非替尼处理组、阿霉素联合吉非替尼处理组、长春... 目的探讨斑马鱼耐药基因ATP结合盒亚家族B成员4(ABCB4)与Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路的关系。方法取野生型斑马鱼和转基因斑马鱼均设置空白对照组、阿霉素处理组、长春碱处理组、吉非替尼处理组、阿霉素联合吉非替尼处理组、长春碱联合吉非替尼处理组。每组100枚胚胎分别进行药物处理至第5天,每组取第5天斑马鱼幼鱼50枚进行实验。采用罗丹明123实验检测野生型斑马鱼耐药程度,酶标仪检测转基因的斑马鱼荧光强度,活细胞工作站检测荧光分布位置。Western blot法检测转基因的斑马鱼β-catenin、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、 ATP结合盒亚家族B成员4(ABCB4)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的蛋白水平。结果罗丹明123实验证实经阿霉素和长春碱药物暴露后的斑马鱼体内产生耐药, EGFP荧光强度检测结果表明经阿霉素和长春碱药物暴露后的转基因斑马鱼荧光强度高,经阿霉素和长春碱药物暴露后的转基因斑马鱼体内β-catenin的累积升高伴随着EGFP和ABCB4蛋白的增加。结论斑马鱼体内Wnt/β-catenin信号通路参与斑马鱼abcb4基因的激活与耐药。 展开更多
关键词 斑马鱼 WNT/Β-CATENIN信号通路 ATP结合盒亚家族B成员4(ABCB4) 耐药
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rpl15在斑马鱼胚胎中的表达形式探究 被引量:3
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作者 周唯君 彭涛 +5 位作者 周栋珍 杨懿琛 周艳华 李化 何志旭 舒莉萍 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2021年第8期9-15,共7页
目的探究rpl15基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达形式。方法利用NCBI和Ensemble数据库进行rpl15基因的共线性分析和Rpl15蛋白质序列相似性分析,使用MEGA X软件绘制进化树;构建pCS2^(+)-rpl15重组质粒,再利用T3聚合酶制备地高辛标记的rpl1... 目的探究rpl15基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达形式。方法利用NCBI和Ensemble数据库进行rpl15基因的共线性分析和Rpl15蛋白质序列相似性分析,使用MEGA X软件绘制进化树;构建pCS2^(+)-rpl15重组质粒,再利用T3聚合酶制备地高辛标记的rpl15反义RNA探针,用全胚胎原位杂交检测rpl15基因的mRNA水平的表达;通过Western blot检测24、48和72 hpf斑马鱼胚胎中Rpl15蛋白的表达。结果在进化过程中,rpl15基因相对保守。构建了pCS2^(+)-rpl15重组质粒,原位杂交结果显示在24 hpf,rpl15基因在斑马鱼的几乎所有细胞中广泛表达;到48 hpf,rpl15在中枢神经系统的表达最强并且在胰腺的表达也开始显现;72 hpf仍然可见rpl15在后脑中的表达以及胰腺、肝和肠道中的表达。Western blot结果显示24、48和72 hpf斑马鱼胚胎中Rpl15蛋白的相对表达量随时间增加而增多。结论系统观察了斑马鱼发育过程中rpl15的表达部位及表达水平的变化,为斑马鱼rpl15缺失模型的建立提供了实验基础。 展开更多
关键词 斑马鱼 rpl15基因 原位杂交 基因表达 反义mRNA 胚胎发育
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胎儿血红蛋白的表达调控 被引量:1
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作者 刘含 杨红兰 +1 位作者 何志旭 张鹏 《生理科学进展》 2022年第1期63-67,共5页
胎儿血红蛋白是胎儿体内主要的血红蛋白类型,是由两条α肽链和两条γ肽链组成的四聚体。出生后胎儿血红蛋白在人体中的表达急剧降低至1%,由两条α肽链和两条β肽链组成的成人血红蛋白取而代之成为主要的血红蛋白类型。β地中海贫血和镰... 胎儿血红蛋白是胎儿体内主要的血红蛋白类型,是由两条α肽链和两条γ肽链组成的四聚体。出生后胎儿血红蛋白在人体中的表达急剧降低至1%,由两条α肽链和两条β肽链组成的成人血红蛋白取而代之成为主要的血红蛋白类型。β地中海贫血和镰刀型细胞贫血发病原因均基于β-珠蛋白基因发生突变,致使β-珠蛋白合成不足或异常,进而引起一系列临床症状。诸多实验结果及临床疗效表明,提高患者体内γ-珠蛋白的表达可部分替代异常β-珠蛋白从而有效缓解患者的临床症状。随着基因治疗的发展,如何安全高效的再激活胎儿血红蛋白的表达成为治疗β型地中海贫血和镰刀型细胞贫血患者的重要科学命题。本文重点回顾近年来γ-珠蛋白表达的调控机制,以期对寻找更加有效激活胎儿血红蛋白的方法提供参考。 展开更多
关键词 胎儿血红蛋白 Β-地中海贫血 转录因子 表观遗传
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下调rpl15基因的表达抑制斑马鱼早期造血的发育
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作者 周唯君 周栋珍 +5 位作者 彭涛 杨懿琛 周艳华 李化 舒莉萍 何志旭 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第17期1611-1618,共8页
目的探究核糖体蛋白L15(ribosomal protein l15,rpl15)基因表达下调对斑马鱼早期造血发育的影响。方法设计并合成rpl15吗啉代反义寡核苷酸(morphilino antisense oligo,MO),通过显微注射到单细胞期斑马鱼(0~0.75 hpf)的受精卵中来下调rp... 目的探究核糖体蛋白L15(ribosomal protein l15,rpl15)基因表达下调对斑马鱼早期造血发育的影响。方法设计并合成rpl15吗啉代反义寡核苷酸(morphilino antisense oligo,MO),通过显微注射到单细胞期斑马鱼(0~0.75 hpf)的受精卵中来下调rpl15的表达,通过qRT-PCR和Western blot技术验证下调rpl15基因表达的有效性。使用体式显微镜分别观察注射rpl15 MO(MO)组与野生型(WT)组的发育情况。O-dianisidine染色检测血红蛋白表达的情况,qRT-PCR检测红系特异性转录因子hbae3、hbbe1的表达变化。全胚原位杂交和qRT-PCR检测红系特异性转录因子gata1、髓系转录因子pu.1、粒系转录因子mpo、定向造血标志转录因子runx1和c-myb、原始祖细胞造血标志物scl和lmo2等早期造血发育过程的关键转录因子的表达变化。TUNEL实验检测造血组细胞的凋亡变化。结果显微注射rpl15 MO能显著下调斑马鱼rpl15的表达,与WT组相比,MO组表现出体节弯曲、发育迟缓、心包水肿等异常表型。MO组血红蛋白合成量与hbae3、hbbe1的表达量相较于WT组明显减少(P<0.05)。原位杂交及qRT-PCR结果表明,gata1的表达明显减少(P<0.05),pu.1、mpo、runx1、c-myb的表达无明显变化,scl的表达明显减少(P<0.01),lmo2的表达无明显变化。TUNEL实验显示造血祖细胞的凋亡无明显变化。结论下调rpl15的表达抑制了斑马鱼早期的造血发育,并可能与gata1和scl表达明显降低有关。 展开更多
关键词 rpl15 造血发育 斑马鱼 吗啉代反义寡核苷酸
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