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重组猫IFN-α的质粒构建、真核表达及体外抗病毒活性分析
1
作者 李沛恒 邹万成 +5 位作者 陈竞 张国庆 崔春梅 蒋嵘 金宁一 李昌 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期17-24,共8页
本文为探究猫IFN-α(FeIFN-α)在体外MDCK、F81细胞中的抗病毒效果,为后续体内实验提供参考。根据猫IFN-α(GenBank登录号:NP_001027000.1)序列并添加6×His标签,合成后通过pUC57载体进行克隆,然后亚克隆至pcDNA3.1载体,获得含有目... 本文为探究猫IFN-α(FeIFN-α)在体外MDCK、F81细胞中的抗病毒效果,为后续体内实验提供参考。根据猫IFN-α(GenBank登录号:NP_001027000.1)序列并添加6×His标签,合成后通过pUC57载体进行克隆,然后亚克隆至pcDNA3.1载体,获得含有目的基因的真核表达质粒,转染293T细胞,通过Western blot检测FeIFN-α的表达情况。通过重组绿色荧光蛋白水疱性口炎病毒(VSV-GFP)感染细胞实验,利用结晶紫染色法进行FeIFN-α抗病毒活性初步分析并确定最佳稀释倍数,通过荧光观察法、流式细胞术检测其抗病毒活性,最后通过相对荧光定量qPCR技术检测猫IFN-α对干扰素刺激基因(ISG15、MX1、OAS1)的调控作用。结果表明,成功表达FeIFN-α并具有生物学活性,且可以明显抑制VSV-GFP病毒侵染F81、MDCK细胞,qPCR结果分析表明猫IFN-α在F81、MDCK细胞中均可有效诱导ISG15、MX1、OAS1基因上调。本研究结果为后续犬猫体内抗病毒实验提供参考依据。 展开更多
关键词 猫IFN-α 构建与表达 抗病毒活性 干扰素刺激基因
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TGEV-RBD基因在昆虫杆状病毒中的表达及鉴定 被引量：4
2
作者 伊立超 李乐天 +6 位作者 郝嘉翼 时小双 张爽 徐鹏 任世斌 高旭 李昌 《动物医学进展》 北大核心 2021年第9期65-70,共6页
旨在获得具有天然结构且有反应原性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)受体结合域(RBD)蛋白。受体结合域是决定病毒宿主和嗜性的关键因素。根据猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S)序列(GenBank:ABC72414.1),设计、优化并合成其受体结合域(RBD)部分... 旨在获得具有天然结构且有反应原性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)受体结合域(RBD)蛋白。受体结合域是决定病毒宿主和嗜性的关键因素。根据猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S)序列(GenBank:ABC72414.1),设计、优化并合成其受体结合域(RBD)部分,亚克隆至杆状病毒pFastBacTMDual上,获得重组质粒,命名为pFBD-TGR。将该质粒转化DH10Bac感受态细胞中,筛选较大的白色菌落,获得重组杆状质粒Bacmid-TGR,转染至sf9细胞中进行拯救病毒,转染后5 d~7 d,收上清,传至第3代,应用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测sf9细胞上清,进行目的蛋白表达鉴定。结果显示,重组穿梭质粒Bacmid-TGR构建成功,Western blot结果证明,杆状病毒表达了TGEV-RBD蛋白且能与Strep tag抗体和抗猪传染性胃肠炎病毒多克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光结果证明,成功地表达了TGEV-RBD蛋白,为进一步开展猪传染性胃肠炎病毒抗体研究以及新型疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 杆状病毒 受体结合域 蛋白表达
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抗PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
3
作者 徐鹏 吉卫龙 +7 位作者 伊立超 张爽 郝嘉翼 高子函 任世斌 时小双 任林柱 李昌 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期115-121,共7页
为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Ca... 为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Cap纯化蛋白,4℃包被过夜,5%脱脂乳封闭60 min,待检血清稀释比例为1∶800,反应条件为37℃、45 min,酶标抗体稀释比例为1∶5000,反应条件为37℃、60 min,底物显色时间为10 min,Cut of f值为0.157,灵敏度可达102400倍。成功建立的抗PCV4Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、重复性和特异性。可为检测PCV4候选疫苗的特异性抗体水平提供一种精准、高效的方法。 展开更多
关键词 猪圆环病毒4型 免疫效果检测 间接ELISA方法
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