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中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因的分离、克隆和序列分析 被引量：8
1
作者 许雪梅 司静懿 +5 位作者 刘世德 徐建青 刘朝奇 李昆 陈浩 宋国兴 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第3期185-191,共7页
目的分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ，经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标本中感染ＨＰＶ型别，选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得... 目的分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ，经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标本中感染ＨＰＶ型别，选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因，将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体，进行双向测序、分析。结果构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒，命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。ＤＮＡ序列分析表明，该序列全长７７６ｂｐ，与已发表的德国标准株长度相等，但其核苷酸顺序的第５５７位核苷酸“Ｔ”变为“Ｃ”，即Ｅ６的终止密码子ＴＡＡ变为谷氨酰胺密码子ＣＡＡ。结论中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的基因结构与德国标准株ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因之间存在差异。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 E6E7基因 宫颈癌 序列分析
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单纯疱疹病毒I型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究 被引量：6
2
作者 朱明昭 刘宏伟 +3 位作者 刘晓娟 韩晔华 杨宝玲 宋国兴 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期67-70,共4页
目的构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白Ｄ重组质粒ＤＮＡ疫苗，初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果，为研制ＨＳＶ－１新型疫苗奠定基础。方法用ＰＣＲ的方法从ＨＳＶ－１病毒基因组中扩增糖蛋白Ｄ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　... 目的构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白Ｄ重组质粒ＤＮＡ疫苗，初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果，为研制ＨＳＶ－１新型疫苗奠定基础。方法用ＰＣＲ的方法从ＨＳＶ－１病毒基因组中扩增糖蛋白Ｄ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄ，ｇＤ）基因，利用基因重组技术构建重组质粒；将重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测表达产物；于ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后腿胫前肌注射免疫，０、２周各免疫１次，１００μｇ／次。初次免疫后０、２、４、６周眼眶采血，ＥＬＩＳＡ间接法检测抗体。结果重组质粒酶切出相应大小片段，经测序证实为ＨＳＶ－１ｇＤ序列。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ证实能够在体外真核细胞中表达。免疫小鼠后，产生特异性抗体，抗体滴度１∶２０００。结论ＨＳＶ－１ｇＤ重组质粒ＤＮＡ有可能作为ＨＳＶ－１的ＤＮＡ疫苗，用于防治ＨＳＶ－１感染及其相关疾病。 展开更多
关键词 单纯疱疹病毒 角膜炎 DNA疫苗 糖蛋白D 构建
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白介素2基因佐剂协同单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗免疫诱导的特异性免疫应答 被引量：11
3
作者 刘晓娟 朱明昭 +6 位作者 宋国兴 许于飞 刘宏伟 王盛 杨宝玲 董方田 许雪梅 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期67-72,共6页
目的研究白介素2(IL-2)cDNA协同单纯疱疹病毒1型(HSV-1)gD核酸疫苗免疫对机体体液免疫和细胞免疫应答的影响,以及在HSV-1病毒角膜攻击时的保护效果。方法利用pcDNA3.1载体分别构建HSV-1糖蛋白D和IL-2的真核表达质粒pgD和pIL-2,体外鉴定... 目的研究白介素2(IL-2)cDNA协同单纯疱疹病毒1型(HSV-1)gD核酸疫苗免疫对机体体液免疫和细胞免疫应答的影响,以及在HSV-1病毒角膜攻击时的保护效果。方法利用pcDNA3.1载体分别构建HSV-1糖蛋白D和IL-2的真核表达质粒pgD和pIL-2,体外鉴定其表达。动物实验分为pcDNA3.1空载体对照组、pgD单独免疫组和pgD+pIL-2联合免疫组3组,具体为通过肌肉免疫接种BALB/c小鼠3次,间隔2周,每次接种质粒100μg,第3次免疫后2周,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体滴度并做亚型分析,利用3H-TdR掺入法进行Th细胞增殖实验,ELISA试剂盒检测Th细胞分泌的IL-2、IFN-γ和IL-10水平,耳廓肿胀实验检测迟发型超敏反应(DTH)反应;HSV-1病毒角膜攻击后,裂隙灯显微镜观察角膜上皮病变。结果与pgD单独免疫组相比,pIL-2的协同免疫可以显著提高IgG2a抗体滴度、Th细胞增殖反应和DTH反应,Th细胞分泌IL-2和IFN-γ水平也显著提高,IL-10水平明显下降。在动物保护实验中,pIL-2的协同免疫明显增强了pgD疫苗在病毒攻击时对角膜的保护效果。结论IL-2cDNA的协同免疫可以显著提高pgD核酸疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答水平,增加核酸疫苗的免疫保护效果。 展开更多
关键词 DNA疫苗 白介素2 单纯疱疹病毒1型 角膜炎
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尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6、11型的检测及L1基因的序列分析 被引量：13
4
作者 张明策 刘跃华 +5 位作者 刘世德 张宝祥 司静懿 许雪梅 陈莲凤 宋国兴 《中国医学科学院学报》 CSCD 北大核心 2000年第5期463-466,共4页
目的 检测尖锐湿疣患者组织中人乳头瘤病毒 (HPV)6型和 11型的感染率，分析 L1晚期基因序列及其蛋白质的氨基酸序列，为基因工程疫苗的研究提供依据。方法 采用 PCR方法测定北京和锦州两地区 34例尖锐湿疣患者病损组织中 HPV6型及 11型... 目的 检测尖锐湿疣患者组织中人乳头瘤病毒 (HPV)6型和 11型的感染率，分析 L1晚期基因序列及其蛋白质的氨基酸序列，为基因工程疫苗的研究提供依据。方法 采用 PCR方法测定北京和锦州两地区 34例尖锐湿疣患者病损组织中 HPV6型及 11型的感染率 ,并扩增 L1晚期基因，构建重组测序质粒，双脱氧法测序观察其变异状况。结果 HPV11型感染率为 73.5％ (25/34)， 6型感染率为 44.1％ (15/34),其中两型混合感染率为 17.6％ (6/34)。 11型 L1基因 7～ 8个碱基变异，推导的蛋白质一级结构中可能有 1～ 3个氨基酸变异， 6型 L1基因仅有 3个碱基发生同义突变。结论 检测的 34例患者中以 HPV11型感染为主，兼有 6型和两型的混合感染。 11型 L1基因及蛋白有一定变异， 6型 L1基因仅发生少数碱基同义突变。 展开更多
关键词 尖锐湿疣 人乳头瘤病毒 L1基因 序列分析
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人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应 被引量：4
5
作者 许雪梅 朱明昭 +3 位作者 张明策 司静懿 李昆 宋国兴 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期301-306,共6页
目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PC... 目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 E6基因 E7基因 DNA疫苗 细胞毒性T淋巴细胞
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人乳头瘤病毒6型基因组晚期区序列分析 被引量：3
6
作者 王淼 张明策 +2 位作者 许雪梅 陈连凤 宋国兴 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期568-572,共5页
目的初步分析我国尖锐湿疣患者病变组织分离的乳头瘤病毒6型(HPV-6)基因组晚期区编码序列变异情况。方法采用重叠PCR设计,分别从HPV-6阳性尖锐湿疣患者病变组织扩增出主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2基因片段,插入质粒载体克隆,经测序... 目的初步分析我国尖锐湿疣患者病变组织分离的乳头瘤病毒6型(HPV-6)基因组晚期区编码序列变异情况。方法采用重叠PCR设计,分别从HPV-6阳性尖锐湿疣患者病变组织扩增出主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2基因片段,插入质粒载体克隆,经测序、拼接获得HPV-6基因组晚期区序列。结果得到的两条长2869bp的HPV-6晚期区序列(GenBank序列索取号AY015006,AY015008)均具有完整的L1和L2开放阅读框(ORF),与原型序列比较,在L1和L2ORF中共有9个核苷酸变异,其中错义突变4个(有3个发生在L2ORF,1个在L1ORF)。分子进化分析表明,克隆的晚期区序列属于HPV-6b亚型。结论HPV-6基因组晚期区编码序列非常保守(核苷酸变异率小于0.28%),并且L1ORF比L2ORF更为保守,其中位于L1ORF中7081位的A→G和7099位的G→A两处共有突变在我国HPV-6分离物中具有代表性。本研究首次从我国尖锐湿疣组织标本克隆了HPV-6基因组晚期区全长编码序列。 展开更多
关键词 尖锐湿疣 人乳瘤病毒6型 晚期区序列分析 克隆
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H_2O_2对大鼠肝卵圆细胞株WB-F344细胞膜理化特性、脂质过氧化及基因组DNA的影响 被引量：2
7
作者 施广璞 李芸 +1 位作者 霍淑敏 吴元德 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期247-250,共4页
目的 研究小剂量(100 nmol/L)H_2O_2对大鼠肝卵圆细胞株WB-F344细胞膜理化特性、脂质过氧化及基因组DNA的影响。方法利用标记膜脂及膜蛋白质的荧光标记物1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)和N-(3芘)马来酰亚胺[N-(3P)M]标记不同剂量H_2O_... 目的 研究小剂量(100 nmol/L)H_2O_2对大鼠肝卵圆细胞株WB-F344细胞膜理化特性、脂质过氧化及基因组DNA的影响。方法利用标记膜脂及膜蛋白质的荧光标记物1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)和N-(3芘)马来酰亚胺[N-(3P)M]标记不同剂量H_2O_2作用及经H_2O_2多次作用后发生转化的WB细胞，通过测定其荧光偏振度确定膜理化特性的改变；以硫代巴比妥酸(TBA)法测定其脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量的变化；以及利用溴化乙锭(EB)作荧光探针，通过DNA-EB结合物荧光强度的变化确定其基因组DNA的损伤程度。结果小剂量(100 nmol/L)H2O2的一次作用可使膜蛋白运动度增加，膜脂流动性增大，MDA的含量增高；H_2O_2的多次作用使上述变化更为显著。大剂量(1 mmol/L)、中剂量(100 μmol/L)的H_2O_2作用细胞后可直接损伤基因组DNA，小剂量H2O2的一次作用虽然不能直接损伤基因组DNA，但多次作用后却可使基因组DNA受损。结论H_2O_2可诱使WB细胞膜理化特性发生改变，脂质过氧化产生及造成基因组DNA损伤，此可能与H_2O_2的致、促癌作用有关。 展开更多
关键词 过氧化氢 膜理化特性 脂质过氧化 DNA损伤 肝卵圆细胞株 WB-F344细胞
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人乳头瘤病毒16型E7C端亚基因片段的克隆与表达
8
作者 徐建青 司静懿 +3 位作者 宋国兴 刘世德 李昆 陈浩 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第5期373-378,共6页
目的旨在获得无转化活性而保留抗原性的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７Ｃ端，为进一步研制抗ＨＰＶ１６疫苗打下基础。方法应用自行设计合成的引物进行ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ端亚基因片段，并克隆入真核表达载体ｐＬＮＣＸ... 目的旨在获得无转化活性而保留抗原性的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７Ｃ端，为进一步研制抗ＨＰＶ１６疫苗打下基础。方法应用自行设计合成的引物进行ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ端亚基因片段，并克隆入真核表达载体ｐＬＮＣＸ。结果准确获得含有Ｅ７Ｃ亚基因片段的重组质粒ｐＬＮＣＥ７Ｃ，将ｐＬＮＣＥ７Ｃ转染Ｂ１６细胞。对Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交阳性克隆应用Ｅ７多抗进行免疫组织化学方法检测，检出Ｅ７Ｃ的表达。结论所构建的表达质粒适于ＤＮＡ疫苗的制备。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒16 E7C亚基因 DNA疫苗
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超氧阴离子自由基致NIH3T3细胞DNA损伤与c-myc基因表达 被引量：2
9
作者 余斌 李芸 +2 位作者 盛齐 廖钢陵 吴元德 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期259-262,共4页
目的　研究超氧阴离子自由基 (O2 .- )对 NIH3T3细胞 DNA的损伤及其脂质过氧化作用和对 c- m yc基因表达的影响。方法　用黄嘌呤 -黄嘌呤氧化酶 (X- XO)系统产生 O2 .- ;测定 DNA-溴乙锭结合物荧光强度变化确定 DNA损伤程度 ;以硫代巴... 目的　研究超氧阴离子自由基 (O2 .- )对 NIH3T3细胞 DNA的损伤及其脂质过氧化作用和对 c- m yc基因表达的影响。方法　用黄嘌呤 -黄嘌呤氧化酶 (X- XO)系统产生 O2 .- ;测定 DNA-溴乙锭结合物荧光强度变化确定 DNA损伤程度 ;以硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)含量 ;以细胞原位杂交法检测 c- myc基因表达。结果　高剂量 O2 .-能直接引起 DNA断裂损伤。O2 .-作用于完整细胞 ,MDA含量及 DNA断裂损伤显著增加 ,过氧化氢酶能明显抑制此效应。中、高剂量 O2 .- 能引起明显的 c- myc基因表达。结论　 O2 .- 引起细胞 DNA损伤与过氧化氢的形成有关 ,其损伤的途径可能是通过膜脂质过氧化 ;O2 .- 诱导 NIH3T3细胞 c- m yc基因表达与剂量密切相关。 展开更多
关键词 超氧阴离子自由基 DNA损伤 脂质过氧化 基因表达
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