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四种主要黄萎病致病菌微滴数字PCR检测方法的建立及应用
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作者 翁慧婷 郭惠明 +4 位作者 程红梅 李君 张超 刘海洋 苏晓峰 《生物技术通报》 北大核心 2025年第10期186-195,共10页
【目的】建立一种同时检测4种黄萎病致病菌的微滴式数字PCR(ddPCR)方法,为及时、准确定量监测该病原真菌的生长动态,进行早期诊断和风险评估奠定基础。【方法】通过比对4种黄萎病致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae,Vd)、长孢轮枝菌... 【目的】建立一种同时检测4种黄萎病致病菌的微滴式数字PCR(ddPCR)方法,为及时、准确定量监测该病原真菌的生长动态,进行早期诊断和风险评估奠定基础。【方法】通过比对4种黄萎病致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae,Vd)、长孢轮枝菌(V.longisporum,Vl)、非苜蓿轮枝菌(V.nonalfalfae,Vna)和黑白轮枝菌(V.albo-atrum,Vaa)的ITS(Internal transcribed spacer)序列(Vd,KY039312.1;Vl,KX058040.1;Vna,KT362917.1和Vaa,MH856937.1),选取保守区域设计引物和探针。结合微滴式数字PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)筛选最佳引物,优化ddPCR最佳反应体系,并测定方法的特异性与灵敏度。【结果】建立方法的最佳引物/探针组为Ver5;最佳退火温度为58℃,引物浓度为500 nmol/L和探针浓度为250 nmol/L。特异性检测结果显示,该方法能够特异性识别4种黄萎病致病菌,对包括7种真菌和6种细菌在内的非靶标微生物无交叉扩增;对于Vd、Vl、Vna、Vaa的检测限分别为2.1×10^(-6)、1.6×10^(-6)、6.9×10^(-4)、3.6×10^(-5)ng/μL。选取50个棉花和50份土壤样品展开检测分析,结果表明相较于q PCR,ddPCR方法的检出率呈现出显著优势,且检测灵敏度分别提高了46%和51%。【结论】建立的ddPCR方法检测4种黄萎病致病菌特异性强,灵敏度高,稳定可靠,为黄萎病的精准检测提供了重要的技术手段。该方法有利于海关检验检疫与植物病虫害监管等领域,提高病害防控的科学性与时效性。 展开更多
关键词 作物黄萎病 轮枝菌 数字PCR 实时荧光定量 精准检测
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