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马源白介素受体拮抗因子的表达及其体外抗炎机制的研究
1
作者
李柄霖
李佳欣
+2 位作者
郭兴
林跃智
王晓钧
《中国预防兽医学报》
北大核心
2025年第2期185-193,共9页
白介素受体拮抗因子(IL-1Ra)是细胞因子IL-1家族的主要成员,也是一种重要的抗炎因子。为评估马源IL-1Ra在马属动物中的抗炎潜力,本研究构建原核表达质粒p GEX-6p-1-IL-1Ra,经测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),于不同温度下经IPTG诱...
白介素受体拮抗因子(IL-1Ra)是细胞因子IL-1家族的主要成员,也是一种重要的抗炎因子。为评估马源IL-1Ra在马属动物中的抗炎潜力,本研究构建原核表达质粒p GEX-6p-1-IL-1Ra,经测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),于不同温度下经IPTG诱导表达后,利用GST标签蛋白纯化试剂盒纯化后通过SDS-PAGE检测重组IL-1Ra蛋白(rIL-1Ra)的表达及纯化效果。结果显示,在16℃、25℃、37℃诱导后,均在43 ku处出现目的条带,且纯化后的目的条带单一。通过流式细胞术检测不同浓度rIL-1Ra对巨噬细胞凋亡的影响;采用单荧光素酶试验检测不同浓度rIL-1Ra在各时间点对IL-1β激活的NF-κB荧光素酶报告系统活性的影响(由各实验组与阴性对照组荧光值的比值确定);采用间接免疫荧光试验(IFA)检测rIL-1Ra对NF-κB信号通路中P65蛋白细胞内定位的影响;通过荧光定量PCR(qPCR)检测rIL-1Ra对LPS诱导炎症细胞因子转录水平的影响。流式细胞术结果显示,不同浓度rIL-1Ra作用的马巨噬细胞凋亡比例均约2%,与阴性对照组均无显著差异。证明不同浓度r IL-1Ra对马巨噬细胞的凋亡无影响。单荧光素酶试验结果显示,作用4 h后,与IL-1β+PBS组相比,IL-1β+rIL-1Ra组与阴性对照组细胞荧光值的比值均极显著降低(P<0.0001),且当rIL-1Ra浓度≥1.4 ng/m L时,与IL-1β+PBS组相比,IL-1β+rIL-1Ra组与阴性对照组细胞荧光值的比值均显著和极显著降低(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。IFA结果显示,与阴性对照组相比,加入IL-1β后细胞核内的红色荧光强度提高并聚集,且随着IL-1β剂量的增加荧光逐渐增强。但IL-1β+rIL-1Ra组细胞核中的荧光减弱并逐渐消失。qPCR检测结果显示,与阴性对照组相比,在LPS刺激后细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α的转录水平均极显著升高(P<0.01、P<0.001、P<0.0001)。但在LPS作用后4 h~8 h加入不同浓度(250 ng/m L~2000 ng/m L)rIL-1Ra的细胞中上述细胞因子的转录水平均显著和极显著降低(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。上述结果表明,马源rIL-1Ra对马巨噬细胞的凋亡无影响,能够有效拮抗IL-1β的活性,抑制IL-1β诱导P65蛋白的核易位,并抑制LPS诱导的马巨噬细胞的炎症反应。本研究为马属动物炎症性疾病的治疗提供了新的策略和参考依据,同时为后续优化rIL-1Ra的生物学特性及体内应用研究奠定了基础。
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关键词
马源IL-1Ra
马属动物
抗炎作用
基因克隆
原核表达
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职称材料
稳定表达马NLRP3 HEK293T细胞系的构建及用于马NLRP3炎性小体的研究
被引量：
1
2
作者
夏慧娟
李鸿鑫
+1 位作者
林跃智
王晓钧
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第4期401-410,共10页
为构建稳定表达马NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(eqNLRP3)的细胞系,并用于eqNLRP3炎性小体激活的研究,本研究采用同源重组的方法将经PCR扩增的eqNLRP3和GFP基因克隆至pLPCX中,构建重组表达质粒pLPCX-Flag-eqNLRP3-GFP,经PCR和测序鉴...
为构建稳定表达马NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(eqNLRP3)的细胞系,并用于eqNLRP3炎性小体激活的研究,本研究采用同源重组的方法将经PCR扩增的eqNLRP3和GFP基因克隆至pLPCX中,构建重组表达质粒pLPCX-Flag-eqNLRP3-GFP,经PCR和测序鉴定正确后与pCGP、pVSV-G共转染HEK293T细胞,48 h后获得携带eqNLRP3的慢病毒。将该慢病毒感染HEK293T细胞,并采用嘌呤霉素筛选携带绿色荧光(GFP+)的单克隆细胞。采用western blot鉴定该细胞中eqNLRP3蛋白的表达、反应原性及细胞遗传稳定性。Western blot结果显示在146.1 ku处出现特异性条带,且传至1、4、7、10代的细胞均出现该条带,表明获得稳定表达eqNLRP3蛋白的HEK293T细胞系HEK293Teq NLRP3(2G1细胞)。采用NLRP3特异性激活剂尼日利亚菌素(Nig)处理2G1细胞1 h;将表达质粒pCDNA3.1-eqASC-HA转染2G1细胞,加入Nig处理1 h,采用激光共聚焦显微镜分别观察上述细胞中e NLRP3的聚化状态,及在2G1细胞中表达eqASC后能否形成ASC斑点(eqNLRP3-eqASC的复合物,即NLRP3炎性小体激活的典型特征)。结果显示,正常2G1细胞中呈绿色荧光的eqNLRP3弥散分布于细胞质中,加入Nig后弥散的eqNLRP3在细胞质中形成典型绿色荧光的点状聚集。转染表达eqASC质粒的2G1细胞中出现的红色荧光(eqASC)主要在细胞质中呈弥散性分布;转染表达eqASC的2G1细胞用Nig处理后形成2.5μm的中间呈绿色荧光四周呈红色荧光的典型ASC斑点。上述结果表明2G1细胞可以响应特异性激活剂并诱导eqNLRP3的聚化,招募ASC形成ASC斑点。将本实验室构建的iGLuc报告系统中的4种表达炎性小体蛋白质粒分别与EIV各蛋白对应质粒共转染HEK293T细胞,24 h后利用该报告系统检测各组细胞中的荧光素酶活性;采用western blot检测各共转染细胞中各EIV蛋白的表达对该系统中4种炎性小体蛋白表达的影响,通过上述两个试验筛选能够激活eqNLRP3炎性小体的EIV蛋白。iGLuc报告系统检测结果显示,仅表达EIV M2蛋白质粒的细胞上清中荧光素酶活性显著高于阳性对照组(P<0.05);western blot结果显示,EIV M2蛋白的表达对4种炎性小体蛋白的表达均无明显影响,表明EIV M2蛋白激活了eqNLRP3炎性小体。将表达EIV M2蛋白及表达eqASC的质粒共转染2G1细胞,24 h后经激光共聚焦显微镜观察以进一步验证上述结果。结果显示,该组细胞中带绿色荧光的eqNLRP3出现点状聚集,并招募细胞质中带红色荧光的eqASC形成了ASC斑点,与i GLuc报告系统筛选结果一致。上述结果表明,EIV感染对HEK293Teq NLRP3细胞系中的eqNLRP3产生了聚化效应,并招募ASC形成ASC斑点。本研究建立了稳定表达eqNLRP3蛋白的HEK293T细胞系,为马属动物病原感染激活NLRP3炎性小体的评价奠定了物质基础。
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关键词
NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体
马源NLRP3
稳定细胞系
炎症激活
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职称材料
题名
马源白介素受体拮抗因子的表达及其体外抗炎机制的研究
1
作者
李柄霖
李佳欣
郭兴
林跃智
王晓钧
机构
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
动物
疫病
防控
全国
重点
实验室
/
马
传染病
与慢
病毒
病
创新
团队
出处
《中国预防兽医学报》
北大核心
2025年第2期185-193,共9页
基金
黑龙江省自然科学基金引导项目(LH2023C049)
自然科学基金面上项目(32372985)。
文摘
白介素受体拮抗因子(IL-1Ra)是细胞因子IL-1家族的主要成员,也是一种重要的抗炎因子。为评估马源IL-1Ra在马属动物中的抗炎潜力,本研究构建原核表达质粒p GEX-6p-1-IL-1Ra,经测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),于不同温度下经IPTG诱导表达后,利用GST标签蛋白纯化试剂盒纯化后通过SDS-PAGE检测重组IL-1Ra蛋白(rIL-1Ra)的表达及纯化效果。结果显示,在16℃、25℃、37℃诱导后,均在43 ku处出现目的条带,且纯化后的目的条带单一。通过流式细胞术检测不同浓度rIL-1Ra对巨噬细胞凋亡的影响;采用单荧光素酶试验检测不同浓度rIL-1Ra在各时间点对IL-1β激活的NF-κB荧光素酶报告系统活性的影响(由各实验组与阴性对照组荧光值的比值确定);采用间接免疫荧光试验(IFA)检测rIL-1Ra对NF-κB信号通路中P65蛋白细胞内定位的影响;通过荧光定量PCR(qPCR)检测rIL-1Ra对LPS诱导炎症细胞因子转录水平的影响。流式细胞术结果显示,不同浓度rIL-1Ra作用的马巨噬细胞凋亡比例均约2%,与阴性对照组均无显著差异。证明不同浓度r IL-1Ra对马巨噬细胞的凋亡无影响。单荧光素酶试验结果显示,作用4 h后,与IL-1β+PBS组相比,IL-1β+rIL-1Ra组与阴性对照组细胞荧光值的比值均极显著降低(P<0.0001),且当rIL-1Ra浓度≥1.4 ng/m L时,与IL-1β+PBS组相比,IL-1β+rIL-1Ra组与阴性对照组细胞荧光值的比值均显著和极显著降低(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。IFA结果显示,与阴性对照组相比,加入IL-1β后细胞核内的红色荧光强度提高并聚集,且随着IL-1β剂量的增加荧光逐渐增强。但IL-1β+rIL-1Ra组细胞核中的荧光减弱并逐渐消失。qPCR检测结果显示,与阴性对照组相比,在LPS刺激后细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α的转录水平均极显著升高(P<0.01、P<0.001、P<0.0001)。但在LPS作用后4 h~8 h加入不同浓度(250 ng/m L~2000 ng/m L)rIL-1Ra的细胞中上述细胞因子的转录水平均显著和极显著降低(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。上述结果表明,马源rIL-1Ra对马巨噬细胞的凋亡无影响,能够有效拮抗IL-1β的活性,抑制IL-1β诱导P65蛋白的核易位,并抑制LPS诱导的马巨噬细胞的炎症反应。本研究为马属动物炎症性疾病的治疗提供了新的策略和参考依据,同时为后续优化rIL-1Ra的生物学特性及体内应用研究奠定了基础。
关键词
马源IL-1Ra
马属动物
抗炎作用
基因克隆
原核表达
Keywords
equine IL-1Ra
equine
anti-inflammatory
gene cloning
prokaryotic expression
分类号
S858 [农业科学—临床兽医学]
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职称材料
题名
稳定表达马NLRP3 HEK293T细胞系的构建及用于马NLRP3炎性小体的研究
被引量：
1
2
作者
夏慧娟
李鸿鑫
林跃智
王晓钧
机构
吉林
农业
大学
动物
科学
技术
学院
/
动物
医
学院
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室马传染病与慢病毒病创新团队
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第4期401-410,共10页
基金
黑龙江省自然科学基金(LH2023C049)
国家自然科学基金面上项目(32372985)。
文摘
为构建稳定表达马NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(eqNLRP3)的细胞系,并用于eqNLRP3炎性小体激活的研究,本研究采用同源重组的方法将经PCR扩增的eqNLRP3和GFP基因克隆至pLPCX中,构建重组表达质粒pLPCX-Flag-eqNLRP3-GFP,经PCR和测序鉴定正确后与pCGP、pVSV-G共转染HEK293T细胞,48 h后获得携带eqNLRP3的慢病毒。将该慢病毒感染HEK293T细胞,并采用嘌呤霉素筛选携带绿色荧光(GFP+)的单克隆细胞。采用western blot鉴定该细胞中eqNLRP3蛋白的表达、反应原性及细胞遗传稳定性。Western blot结果显示在146.1 ku处出现特异性条带,且传至1、4、7、10代的细胞均出现该条带,表明获得稳定表达eqNLRP3蛋白的HEK293T细胞系HEK293Teq NLRP3(2G1细胞)。采用NLRP3特异性激活剂尼日利亚菌素(Nig)处理2G1细胞1 h;将表达质粒pCDNA3.1-eqASC-HA转染2G1细胞,加入Nig处理1 h,采用激光共聚焦显微镜分别观察上述细胞中e NLRP3的聚化状态,及在2G1细胞中表达eqASC后能否形成ASC斑点(eqNLRP3-eqASC的复合物,即NLRP3炎性小体激活的典型特征)。结果显示,正常2G1细胞中呈绿色荧光的eqNLRP3弥散分布于细胞质中,加入Nig后弥散的eqNLRP3在细胞质中形成典型绿色荧光的点状聚集。转染表达eqASC质粒的2G1细胞中出现的红色荧光(eqASC)主要在细胞质中呈弥散性分布;转染表达eqASC的2G1细胞用Nig处理后形成2.5μm的中间呈绿色荧光四周呈红色荧光的典型ASC斑点。上述结果表明2G1细胞可以响应特异性激活剂并诱导eqNLRP3的聚化,招募ASC形成ASC斑点。将本实验室构建的iGLuc报告系统中的4种表达炎性小体蛋白质粒分别与EIV各蛋白对应质粒共转染HEK293T细胞,24 h后利用该报告系统检测各组细胞中的荧光素酶活性;采用western blot检测各共转染细胞中各EIV蛋白的表达对该系统中4种炎性小体蛋白表达的影响,通过上述两个试验筛选能够激活eqNLRP3炎性小体的EIV蛋白。iGLuc报告系统检测结果显示,仅表达EIV M2蛋白质粒的细胞上清中荧光素酶活性显著高于阳性对照组(P<0.05);western blot结果显示,EIV M2蛋白的表达对4种炎性小体蛋白的表达均无明显影响,表明EIV M2蛋白激活了eqNLRP3炎性小体。将表达EIV M2蛋白及表达eqASC的质粒共转染2G1细胞,24 h后经激光共聚焦显微镜观察以进一步验证上述结果。结果显示,该组细胞中带绿色荧光的eqNLRP3出现点状聚集,并招募细胞质中带红色荧光的eqASC形成了ASC斑点,与i GLuc报告系统筛选结果一致。上述结果表明,EIV感染对HEK293Teq NLRP3细胞系中的eqNLRP3产生了聚化效应,并招募ASC形成ASC斑点。本研究建立了稳定表达eqNLRP3蛋白的HEK293T细胞系,为马属动物病原感染激活NLRP3炎性小体的评价奠定了物质基础。
关键词
NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体
马源NLRP3
稳定细胞系
炎症激活
Keywords
NLRP3 inflammasome
equine NLRP3
stable cell line
activation of inflammation
分类号
S852.65 [农业科学—基础兽医学]
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1
马源白介素受体拮抗因子的表达及其体外抗炎机制的研究
李柄霖
李佳欣
郭兴
林跃智
王晓钧
《中国预防兽医学报》
北大核心
2025
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2
稳定表达马NLRP3 HEK293T细胞系的构建及用于马NLRP3炎性小体的研究
夏慧娟
李鸿鑫
林跃智
王晓钧
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
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