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猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定
1
作者 林琪虹 李长尧 +2 位作者 张朝霞 宋厚辉 翁长江 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期179-184,共6页
为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb... 为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb亚类鉴定试剂盒检测结果显示3D5 MAb为IgM型。采用western blot检测制备的3D5 MAb与293T细胞中过表达的E2蛋白及CSFV感染猪肾细胞(PK-15细胞)后(感染后不同时间)天然表达E2蛋白的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测3D5 MAb与PK-15细胞中天然表达E2蛋白的反应性。Western blot结果显示,过表达E2蛋白的293T细胞和感染CSFV的PK-15细胞中(感染后12 h)均出现了40 ku左右的特异性条带。IFA结果显示,感染CSFV的PK-15细胞中出现红色荧光。以上结果表明,制备的3D5 MAb均能够与过表达的和天然表达的E2蛋白有较强的反应性。利用一系列表达截短的重组E2片段,通过western blot鉴定3D5 MAb识别的抗原表位,结果显示,E2蛋白氨基酸序列中的157REKPFPHRMD167为3D5 MAb的抗原表位。本研究首次制备了CSFV E2蛋白的MAb,并对其进行了表位鉴定,为进一步深入研究CSFV E2蛋白的结构、功能、抗原表位的筛选及新疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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H240R和MGF505-7R基因缺失非洲猪瘟病毒的构建及其生长特性的初步研究 被引量：2
2
作者 周仕君 宋洁 +3 位作者 李帅 刘佳 李江南 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期423-428,共6页
为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响,本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1000 bp的同源臂,分别克隆至pBS-EGFP及pBS-Mcherry载体中,构建同源臂质粒pBS-GFP-H240R和pBS-Mch... 为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响,本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1000 bp的同源臂,分别克隆至pBS-EGFP及pBS-Mcherry载体中,构建同源臂质粒pBS-GFP-H240R和pBS-Mcherry-MGF505-7R,采用PCR和测序鉴定正确。根据CRISPR/Cas9系统sgRNA设计原则设计分别靶向H240R和MGF505-7R基因的小向导RNA(sgRNA),并克隆至pX330载体中,构建重组质粒pX330-sgH240R和pX330-sgMGF505-7R,经测序鉴定正确后,将线性化的同源臂质粒pBS-GFP-H240R与pX330-sgH240R共转染猪肺泡巨噬细胞(PAM),再以ASFV感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建H240R基因缺失病毒ASFV-ΔH240R;采用上述类似的方式构建MGF505-7R基因缺失病毒ASFV-Δ7R;在ASFV-ΔH240R的基础上,将线性化的同源臂质粒pBS-Mcherry-MGF505-7R与pX330-sgMGF505-7R共转染PAM后,再以ASFV-ΔH240R感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建双基因缺失病毒ASFV-ΔH240R-Δ7R。上述3株基因缺失病毒均采用PCR和测序鉴定正确后,均以MOI 1感染PAM,24 h后于荧光显微镜观察;同时采用红细胞吸附试验测定不同培养时间的病毒载量即半数红细胞吸附量(HAD50),并绘制各病毒的生长曲线。结果显示,ASFV-ΔH240R、ASFV-Δ7R及ASFV-ΔH240R-Δ7R感染的PAM分别出现绿色荧光、红色荧光及红绿色双色荧光,而ASFV-WT感染的细胞无荧光,表明正确构建各基因缺失病毒。生长曲线测定结果显示,ASFV-Δ7R和亲本病毒生长曲线基本一致,ASFV-ΔH240R复制水平显著低于亲本病毒(P<0.001),ASFV-ΔH240R-Δ7R复制水平显著高于ASFV-ΔH240R(P<0.01),但仍低于亲本株。表明MGF505-7R基因与病毒的复制无关,但H240R基因与病毒的复制有关,在ASFV-ΔH240R的基础上缺失MGF505-7R基因则可部分恢复病毒的复制能力。本研究构建了3株基因缺失ASFV并测定其生长曲线,为进一步研究ASFV基因功能提供了数据参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 H240R MGF5050-7R 基因缺失病毒
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猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及初步应用
3
作者 俞机敏 刘宏扬 +4 位作者 刘云飞 王尚辉 宋厚辉 张朝霞 翁长江 《中国预防兽医学报》 2025年第8期832-838,共7页
为制备猪伪狂犬病病毒(PRV)gE糖蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究将PRV JM株gE蛋白主要抗原表位区域(aa52~aa238)的基因序列经密码子优化后由公司合成后克隆于pET-32a载体中构建重组表达质粒pET-32a-gE,经原核表达及纯化获得重组gE蛋白(rg... 为制备猪伪狂犬病病毒(PRV)gE糖蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究将PRV JM株gE蛋白主要抗原表位区域(aa52~aa238)的基因序列经密码子优化后由公司合成后克隆于pET-32a载体中构建重组表达质粒pET-32a-gE,经原核表达及纯化获得重组gE蛋白(rgE),采用SDS-PAGE鉴定rgE的表达及纯化效果,并经BCA法测定rgE的浓度。将其免疫BALB/c小鼠。取3次免疫小鼠的脾脏制备脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。通过ELISA筛选杂交瘤细胞株,经western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定MAb的反应性,利用MAb亚类鉴定试剂盒检测其重链和轻链类型。以截短的gE合成多肽作为抗原,采用间接ELISA方法鉴定MAb识别的抗原表位,并利用MAb通过western blot和IFA鉴定PRV野毒株JM及gE基因缺失株PRV JMΔgE/TK中gE蛋白的表达水平。结果显示,经间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌gE蛋白的单克隆细胞株,命名为4C6B。Western blot和IFA均表明本研究筛选的MAb能够特异性识别PRV感染PK-15细胞中表达的gE蛋白;亚类鉴定结果显示MAb重链为IgM型,轻链为κ链。间接ELISA结果显示MAb能够识别gE蛋白中的一个线性B细胞表位131ACHPDLVLGRACVPEAPEMG^(150)。利用制备的MAb腹水进行PRV野毒和gE基因缺失株的鉴定,结果显示该MAb能够有效鉴别PRV JM野毒株与gE缺失株。本研究制备的PRV gE蛋白的4C6B MAb可以用于特异性鉴别PRV JM野毒株和gE基因缺失株,同时也可以为PRV检测方法的建立、PRV基因缺失疫苗的构建以及gE蛋白的生物学功能研究提供生物材料。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 单克隆抗体 gE蛋白 表位鉴定
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