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SNP检测方法在实验动物遗传质量检测中的研究进展和应用
1
作者 张越 李湘茹 +3 位作者 权金强 高彩霞 夏长友 赵生国 《中国实验动物学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期1588-1593,共6页
实验动物作为生命科学研究的重要实验材料,其质量的均一性对实验结果的准确性和可靠性起到关键作用,而实验动物的遗传质量检测是评价实验动物遗传质量高低的重要环节。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为分子标记... 实验动物作为生命科学研究的重要实验材料,其质量的均一性对实验结果的准确性和可靠性起到关键作用,而实验动物的遗传质量检测是评价实验动物遗传质量高低的重要环节。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为分子标记已被广泛应用于实验动物遗传检测,随着现代生物技术的进步,实验动物的SNP遗传质量检测方法也一直在更新。本文主要梳理了目前SNP检测方法在实验动物遗传质量检测中的研究进展和应用,以及各种检测方法的优缺点,以期为实验动物的遗传质量检测提供参考依据。 展开更多
关键词 实验动物 遗传质量 SNP 检测方法
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非洲猪瘟病毒感染过程中巨噬细胞极化表型变化的研究 被引量：1
2
作者 崔宏全 姜成刚 +6 位作者 文莉莉 范宇琴 刘英豪 都兰 王靖飞 赵东明 何希君 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第1期54-62,共9页
为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)对巨噬细胞极化表型的影响,本研究将100ng/mL脂多糖(LPS)+50ng/mL IFN-γ诱导猪肺泡巨噬细胞(PAM)成为M1型巨噬细胞(M1组),用50 ng/mL IL-4诱导PAM成为M2型巨噬细胞(M2组),以不做任何处理的PAM作为对照组。24 ... 为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)对巨噬细胞极化表型的影响,本研究将100ng/mL脂多糖(LPS)+50ng/mL IFN-γ诱导猪肺泡巨噬细胞(PAM)成为M1型巨噬细胞(M1组),用50 ng/mL IL-4诱导PAM成为M2型巨噬细胞(M2组),以不做任何处理的PAM作为对照组。24 h后采用荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞中M1型细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α及M2型细胞因子IL-10及其标志物精氨酸酶-1(Arg-1)、几丁质酶-1(Ym-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)mRNA的转录水平;采用Luminex细胞多因子试剂盒检测各组细胞上清中M1型细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18和M2型细胞因子IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)、IL-10的表达水平;采用NO试剂盒及流式细胞术分别检测各组细胞上清中M1型巨噬细胞代谢物NO的含量及其细胞表面标志物CD80+细胞的占比;采用western blot检测各组细胞中M2型巨噬细胞标志物Arg-1蛋白的表达。结果显示,M1组中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-αmRNA的转录和蛋白分泌水平、IL-1α的分泌水平、NO的含量及CD80+细胞的占比均显著和极显著高于其余两组。M2组中抑炎细胞因子IL-10和Arg-1 mRNA的转录和蛋白的分泌水平均极显著高于其余两组。未检测到IL-18和IL-1RA的表达。在此基础上将ASFV Pig/HLJ/2018株以MOI 1感染PAM,不同时间后(0、12 h、24 h、36 h及48 h)分别按照上述各方法检测PAM中各细胞因子及极化标志物的转录水平及蛋白的分泌水平,分析ASFV感染后巨噬细胞表型的极化方向。结果显示,与对照组相比,ASFV感染后PAM中M1型细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的转录水平均极显著升高,IL-6的转录水平一直维持在较高水平,PAM中M2型细胞因子IL-10及Arg-1的转录水平先升后降,并分别于感染后48h与12 h达到峰值,后者随后下降;Ym-1与PPAR的转录水平均在感染后24 h达到峰值,随后下降;ASFV感染后PAM中部分细胞因子蛋白的分泌水平与其转录水平的变化趋势类似;NO含量显著和极显著升高,CD80+细胞占比显著升高直至达到峰值;Arg-1的表达量均极显著升高(除了感染后48 h),在感染后36 h达到峰值后下降。上述结果表明,ASFV感染后PAM同时向M1型及M2型极化,M1型极化随着感染时间的延长持续存在,而M2型极化则呈先上升后下降的趋势。本研究为进一步探究ASFV感染对宿主免疫状态的影响及宿主如何响应ASFV感染的机制奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 肺泡巨噬细胞 极化
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大豆皂苷Bc对伪狂犬病病毒体外复制影响的研究
3
作者 高柯欣 李艳华 +5 位作者 张艳禾 汤艳东 安同庆 蔡雪辉 周双海 王淑杰 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第6期545-552,共8页
为研究大豆皂苷Bc(SS-Bc)对伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,本研究采用CCK-8法测定SS-Bc对Vero E6细胞的半数细胞毒性浓度(CC_(50))为253.6μg/m L,同时测定了SS-Bc对PRV的半数抑制浓度(IC_(50))为21.61μg/m L。根据上述结果,将不同浓度... 为研究大豆皂苷Bc(SS-Bc)对伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,本研究采用CCK-8法测定SS-Bc对Vero E6细胞的半数细胞毒性浓度(CC_(50))为253.6μg/m L,同时测定了SS-Bc对PRV的半数抑制浓度(IC_(50))为21.61μg/m L。根据上述结果,将不同浓度的SS-Bc(15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL)与PRV-GFP(MOI 0.01)共处理Vero E6细胞,通过倒置荧光显微镜观察含绿色荧光的细胞数量,结合Image J软件分析荧光强度,并采用Reed-Muech法测定细胞上清中的病毒滴度(TCID_(50));进一步采用不同浓度的SS-Bc(30μg/mL、60μg/mL)分别与不同MOI的PRV-GFP(MOI0.05、MOI 0.1及MOI 0.5)共处理Vero E6细胞,24 h后检测上述指标。结果显示,与阳性对照组相比,SS-Bc处理组细胞的相对荧光强度值和细胞上清中病毒的TCID_(50)均极显著降低(P<0.01),且对病毒的抑制作用呈剂量依赖性,60μg/mL时效果最佳;即使在较高MOI PRV感染下,SS-Bc仍极显著抑制该病毒的增殖(P<0.01)。为了确定SS-Bc的最佳给药方式,本实验于PRV-GFP(MOI 0.01)感染后不同时间,以SS-Bc(60μg/mL)处理Vero E6细胞24 h后检测上述指标。结果显示,所有药物处理组的CPE数量、相对荧光强度值和细胞上清中病毒的TCID_(50)均极显著低于阳性对照组(P<0.01),其中PRV感染后1 h和3 h给药时抑制病毒增殖的效果更佳。进一步体外模拟病毒感染各阶段,将SSBc(60μg/mL)与PRV-GFP(MOI 0.1和1)以不同方式处理后接种Vero E6细胞,采用荧光定量PCR(qPCR)检测病毒吸附、内化及复制阶段gB基因mRNA的相对转录水平,在释放阶段测定细胞上清中病毒的TCID_(50),分析SS-Bc对PRV感染的影响。结果显示SS-Bc在PRV的吸附和复制阶段均显著降低了gB基因mRNA的转录水平(P<0.05),但SS-Bc在病毒的内化和释放阶段均无显著影响。综上所述,本研究首次证实SS-Bc在体外能够显著抑制PRV的增殖,主要作用于病毒的吸附和复制阶段;且无论在病毒接种前、同时或接种后给药,SS-Bc均表现出良好的抗病毒效果,其中在病毒进入细胞后给药效果更佳。本研究为SS-Bc作为潜在的抗PRV药物提供了科学依据,并为SS-Bc的进一步研究和临床应用奠定了基础。 展开更多
关键词 大豆皂苷Bc 伪狂犬病病毒 抗病毒
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不同状态禽呼肠孤病毒的冷冻电镜结构研究
4
作者 刘京路 高立 +6 位作者 王有望 祁小乐 张雪利 包珂岩 高玉龙 王笑梅 朱平 《电子显微学报》 北大核心 2025年第1期10-17,共8页
禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)是一种双链RNA病毒,对家禽养殖业构成严重威胁。本文利用冷冻电镜技术解析了ARV病毒的完整病毒颗粒(virion)以及处于转录状态的病毒核心颗粒(T⁃core)的高分辨率三维结构。对比分析表明,ARV病毒virion和... 禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)是一种双链RNA病毒,对家禽养殖业构成严重威胁。本文利用冷冻电镜技术解析了ARV病毒的完整病毒颗粒(virion)以及处于转录状态的病毒核心颗粒(T⁃core)的高分辨率三维结构。对比分析表明,ARV病毒virion和T⁃core颗粒的塔状突起蛋白λC存在明显结构差异,显示其在病毒转录过程中的重要作用。在病毒转录态核心颗粒中,作者发现σA蛋白与双链RNA存在较强结合,并确认了起关键作用的氨基酸残基。同时,分析了ARV病毒内部转录酶复合体RdRP以及基因组三维结构,获得了处于转录过程中ARV病毒核心颗粒内部基因组的三维分布. 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 冷冻电镜 塔状突起 RDRP 双链RNA
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中国盖塔病毒Ⅲ型变异株的全基因组序列分析
5
作者 许浒 冯子萱 +16 位作者 龚帮俊 张思钰 李超 李金昊 郭镇洋 张雪莉 石佳豪 宋紫雨 彭金美 王倩 周国辉 汤艳东 安同庆 蔡雪辉 冷超粮 张洪亮 田志军 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第3期303-307,共5页
盖塔病毒(GETV)是一种广泛分布于亚洲和泛太平洋国家的蚊媒RNA病毒,其感染宿主众多,对猪致病力强。2024年7月至8月,河南省和湖北省的8个规模化养猪场2个月内集中出现哺乳仔猪发烧、腹泻和死亡等临床症状,仔猪发病率约为10%~20%,死亡率高... 盖塔病毒(GETV)是一种广泛分布于亚洲和泛太平洋国家的蚊媒RNA病毒,其感染宿主众多,对猪致病力强。2024年7月至8月,河南省和湖北省的8个规模化养猪场2个月内集中出现哺乳仔猪发烧、腹泻和死亡等临床症状,仔猪发病率约为10%~20%,死亡率高达100%。为探究疾病暴发的原因,本研究在8个猪场分别采集猪肺脏、脾脏、肠道组织,每个猪场合为1个样品,共8份临床样品。采用RT-qPCR和qPCR方法鉴定各疑似病原,结果显示8份样品中非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、PCV3和猪伪狂犬病毒(PRV)均为阴性。进一步利用RT-PCR在8份样品中扩增出GETV的Nsp3和E2基因,8份样品均为GETV阳性,确定本次疫情由GETV引起。测序获得8份样品的Nsp3和E2基因序列,选取其中1株(HN1)分8段扩增各基因序列,利用SeqMan拼接获得HN1株全基因组序列。参照GenBank中Group Ⅰ-Group Ⅳ型GETV代表株的E2基因、Nsp3基因和全基因组序列,利用Megalign软件分析本研究鉴定的GETV与各型GETV代表株E2序列的相似性;利用MEGA7.0构建上述GETV E2基因和全基因组序列(HN1株)的遗传进化树,分析其遗传变异情况;利用Megalign软件分析各型GETV Nsp3氨基酸突变特征。E2基因编码氨基酸序列相似性比对结果显示,本研究鉴定的各株GETV之间E2氨基酸序列的相似性均达100%,同时与Group Ⅲ型代表株GETVV1株E2基因序列的相似性较高(98.5%~98.6%)。基于E2基因和全基因组序列构建的进化树结果显示,本研究鉴定的GETV均属于Group Ⅲ型(Ⅲ型),形成了一个独立分支,将其命名为GETV Ⅲ型变异株。Nsp3氨基酸序列比对分析发现,GETV Ⅲ型变异株与其他GETV相比在S^(329)、T/I^(381)和G^(503)处存在3个特征性氨基酸突变,可以作为鉴别GETV Ⅲ型变异株的分子特征,且特征性氨基酸突变均位于Nsp3的高变结构域(HVD)内,可能与GETV Ⅲ型变异株毒力增强有关。本研究首次鉴定了GETV Ⅲ型变异株,并首次报道GETV Ⅲ型变异株在我国河南省和湖北省引起疫病的集中暴发,对了解我国GETV流行现状以及对其感染的防控均具有重要的指导意义。 展开更多
关键词 盖塔病毒 Ⅲ型变异株 分子特征
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金定鸭(Anas platyrhynchos domesticus)ACSL4基因克隆、组织表达及生物信息学分析研究
6
作者 权金强 张越 +5 位作者 高彩霞 袁浩楠 夏长友 赵生国 李昌文 于海波 《四川农业大学学报》 北大核心 2025年第5期1315-1323,共9页
【目的】为揭示ACSL4基因在脂肪酸合成代谢中的作用机制。【方法】以金定鸭为研究对象,克隆金定鸭ACSL4基因cDNA全长,并通过生物信息学方法分析基因序列结构特征;同时,qRT-PCR检测该基因在金定鸭不同组织中的表达情况。【结果】金定鸭AC... 【目的】为揭示ACSL4基因在脂肪酸合成代谢中的作用机制。【方法】以金定鸭为研究对象,克隆金定鸭ACSL4基因cDNA全长,并通过生物信息学方法分析基因序列结构特征;同时,qRT-PCR检测该基因在金定鸭不同组织中的表达情况。【结果】金定鸭ACSL4基因CDS序列全长2136 bp,编码711个氨基酸,存在多个开放阅读框(ORF)。ACSL4蛋白分子量为79178.18 kD,分子式为C3539H5666N932O1031S44;丙氨酸(Ala)含量最高,占比为6.2%,其亲水性为-0.197,脂肪系数为89.97。通过预测发现ACSL4蛋白在205氨基酸序列处存在5个糖基化位点,并且该蛋白包含4种二级结构,在整个蛋白质中占比分别为α螺旋(39.38%)、延伸链(17.30%)和无规卷曲(43.32%)。基于ACSL4序列的系统进化分析,金定鸭与原鸡、鹅等禽类动物的遗传距离近,与大鼠和小鼠的遗传距离最远。qRT-PCR结果显示,ACSL4基因在脑组织中的表达量高于肝脏、心脏、脾脏、肾脏、胸肌、腹脂、腹肌和卵巢,在肝脏中的表达量最低。【结论】通过解析ACSL4基因的功能,为金定鸭的遗传育种及肉品质改良提供了关键基础数据。 展开更多
关键词 金定鸭 脂肪酸代谢 ACSL4基因 克隆 表达分析
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腺病毒载体介导编辑chNHE1基因对J亚群禽白血病病毒抗性研究
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作者 王震 陈运通 +5 位作者 魏天悦 陈洪岩 王旭光 高玉龙 夏长友 孟庆文 《中国家禽》 北大核心 2025年第2期27-33,共7页
鸡Na^(+)/H^(+)离子交换蛋白-1(chNHE1)是J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的细胞受体,是ALV-J感染的细胞靶点。为了探索鸡抗禽白血病的育种目标,试验构建了定点编辑chNHE1基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统,并对编辑后细胞抗ALV-J感染能力进行评价... 鸡Na^(+)/H^(+)离子交换蛋白-1(chNHE1)是J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的细胞受体,是ALV-J感染的细胞靶点。为了探索鸡抗禽白血病的育种目标,试验构建了定点编辑chNHE1基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统,并对编辑后细胞抗ALV-J感染能力进行评价。结果显示:使用CRISPR/Cas9腺病毒载体介导的ssODNs同源重组方案可以在chNHE1中引入突变,其中36%单克隆细胞株存在W38缺失;T37缺失的细胞对ALV-J感染具备极显著的抗性;W38缺失的细胞对ALV-J感染具有完全抗性,同时具有E35A替换、P36缺失、T37缺失的细胞对ALV-J感染也具有完全抗性。研究表明,CRISPR/Cas9腺病毒载体可以有效地编辑鸡DF-1细胞,W38缺失或E35A替换P36、T37缺失都可以使DF-1对ALV-J感染具有抗性,该方案为培育抗ALV-J感染的基因编辑鸡提供技术储备。 展开更多
关键词 J亚群禽白血病病毒 鸡Na^(+)/H^(+)交换蛋白-1 腺病毒载体 CRISPR/Cas9
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一株H5N6亚型高致病性禽流感病毒的遗传演化及生物学特性研究
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作者 赵志国 田井满 +4 位作者 李明慧 白晓利 宋兴栋 李雁冰 陈化兰 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期117-123,共7页
2023年5月本实验室从家禽的监测样品中分离到一株H5N6亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV),命名为A/chicken/Jiangsu/S1/2023(H5N6)株,简称CK/JS/S1/2023(H5N6)株。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其进行全基因组的分段PCR扩增与测... 2023年5月本实验室从家禽的监测样品中分离到一株H5N6亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV),命名为A/chicken/Jiangsu/S1/2023(H5N6)株,简称CK/JS/S1/2023(H5N6)株。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其进行全基因组的分段PCR扩增与测序分析各基因节段编码的关键氨基酸位点及各基因节段的遗传演化分析,采用Simplot软件分析该病毒全基因组的重配事件,采用交叉血凝抑制试验分析该病毒的抗原性。结果显示,该病毒HA蛋白的裂解位点为PLRERRRKR↓GLF,符合HPAIV的分子特征。关键氨基酸位点分析显示HA蛋白受体结合区域出现S^(133)A和T^(156)A增强病毒与人型受体(α2,6)结合能力的突变;NA蛋白颈部出现了aa59~aa69的缺失;PB1蛋白的D622G、M1蛋白的^(I43)M和T^(215)A及NS1蛋白的I106M,这些位点的突变均可以增强病毒对哺乳动物的致病性。遗传演化分析结果显示,该病毒HA基因属于2.3.4.4b亚分支,NA基因及5个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M)均属于欧亚分支,NS基因属于等位基因A分支(Allele A)。基因重配分析结果显示该病毒是由野鸟源的H5N8和家鸭源的H5N6、H4N6和H3N2AIV形成的一株多元重配病毒。抗原性分析结果显示,该病毒与2.3.4.4b亚分支H5-Re14疫苗株抗原性相匹配。将该病毒以10~1EID_(50)/50μL~10~6EID_(50)/50μL剂量经鼻腔感染小鼠,通过小鼠的存活率和各脏器病毒滴度分析该病毒的致病性。结果显示,感染组小鼠均出现精神沉郁、被毛凌乱、体质量下降等症状,感染该病毒后第4 d开始出现死亡。经计算该病毒对小鼠的半数致死量(MLD_(50))为1.5 log_(10)EID_(50),呈高致病性(MLD_(50)<3 log_(10)EID_(50))。该病毒不经提前适应即可在小鼠的多脏器中有效复制,其在肺脏中的病毒滴度最高,达到7.25 log_(10)EID_(50)/m L。本研究通过对H5N6亚型HPAIV的部分生物学特性研究,为2.3.4.4b亚分支H5亚型HPAI的防控提供数据支持与借鉴。 展开更多
关键词 H5N6亚型 高致病性禽流感病毒 分子特征 遗传演化 抗原性 哺乳动物致病性
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马源白介素受体拮抗因子的表达及其体外抗炎机制的研究
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作者 李柄霖 李佳欣 +2 位作者 郭兴 林跃智 王晓钧 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期185-193,共9页
白介素受体拮抗因子(IL-1Ra)是细胞因子IL-1家族的主要成员,也是一种重要的抗炎因子。为评估马源IL-1Ra在马属动物中的抗炎潜力,本研究构建原核表达质粒p GEX-6p-1-IL-1Ra,经测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),于不同温度下经IPTG诱... 白介素受体拮抗因子(IL-1Ra)是细胞因子IL-1家族的主要成员,也是一种重要的抗炎因子。为评估马源IL-1Ra在马属动物中的抗炎潜力,本研究构建原核表达质粒p GEX-6p-1-IL-1Ra,经测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),于不同温度下经IPTG诱导表达后,利用GST标签蛋白纯化试剂盒纯化后通过SDS-PAGE检测重组IL-1Ra蛋白(rIL-1Ra)的表达及纯化效果。结果显示,在16℃、25℃、37℃诱导后,均在43 ku处出现目的条带,且纯化后的目的条带单一。通过流式细胞术检测不同浓度rIL-1Ra对巨噬细胞凋亡的影响;采用单荧光素酶试验检测不同浓度rIL-1Ra在各时间点对IL-1β激活的NF-κB荧光素酶报告系统活性的影响(由各实验组与阴性对照组荧光值的比值确定);采用间接免疫荧光试验(IFA)检测rIL-1Ra对NF-κB信号通路中P65蛋白细胞内定位的影响;通过荧光定量PCR(qPCR)检测rIL-1Ra对LPS诱导炎症细胞因子转录水平的影响。流式细胞术结果显示,不同浓度rIL-1Ra作用的马巨噬细胞凋亡比例均约2%,与阴性对照组均无显著差异。证明不同浓度r IL-1Ra对马巨噬细胞的凋亡无影响。单荧光素酶试验结果显示,作用4 h后,与IL-1β+PBS组相比,IL-1β+rIL-1Ra组与阴性对照组细胞荧光值的比值均极显著降低(P<0.0001),且当rIL-1Ra浓度≥1.4 ng/m L时,与IL-1β+PBS组相比,IL-1β+rIL-1Ra组与阴性对照组细胞荧光值的比值均显著和极显著降低(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。IFA结果显示,与阴性对照组相比,加入IL-1β后细胞核内的红色荧光强度提高并聚集,且随着IL-1β剂量的增加荧光逐渐增强。但IL-1β+rIL-1Ra组细胞核中的荧光减弱并逐渐消失。qPCR检测结果显示,与阴性对照组相比,在LPS刺激后细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α的转录水平均极显著升高(P<0.01、P<0.001、P<0.0001)。但在LPS作用后4 h~8 h加入不同浓度(250 ng/m L~2000 ng/m L)rIL-1Ra的细胞中上述细胞因子的转录水平均显著和极显著降低(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。上述结果表明,马源rIL-1Ra对马巨噬细胞的凋亡无影响,能够有效拮抗IL-1β的活性,抑制IL-1β诱导P65蛋白的核易位,并抑制LPS诱导的马巨噬细胞的炎症反应。本研究为马属动物炎症性疾病的治疗提供了新的策略和参考依据,同时为后续优化rIL-1Ra的生物学特性及体内应用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 马源IL-1Ra 马属动物 抗炎作用 基因克隆 原核表达
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猪I类白细胞抗原单克隆抗体的制备及其在非洲猪瘟病毒感染机制研究中的初步应用
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作者 王可欣 Weldu Tesfagaber +7 位作者 王婉 尹丽 孔惠 张振江 李芳 高彩霞 步志高 赵东明 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第1期90-95,共6页
猪I类白细胞抗原(SLA I)是机体内至关重要的免疫相关蛋白,是启动特异性细胞毒性T细胞(CTL)免疫应答的核心分子。在机体内,SLA I负责将内源性抗原肽递呈至细胞膜表面,由CD8+T细胞识别,启动机体适应性免疫应答。为了制备SLA I的单克隆抗体... 猪I类白细胞抗原(SLA I)是机体内至关重要的免疫相关蛋白,是启动特异性细胞毒性T细胞(CTL)免疫应答的核心分子。在机体内,SLA I负责将内源性抗原肽递呈至细胞膜表面,由CD8+T细胞识别,启动机体适应性免疫应答。为了制备SLA I的单克隆抗体(MAb),本研究将SLA I-1*04:01等位基因胞外区序列与麦芽糖结合蛋白(MBP)序列连接,在大肠杆菌原核表达系统中表达,获得可溶性重组蛋白MBP-SLA I。经亲和层析纯化后,采用MBP-SLA I免疫BALB/c小鼠3次,采用ELISA检测小鼠血清抗体水平,对血清抗体效价在1:10 000以上的小鼠进一步冲击免疫后,分离小鼠脾脏B淋巴细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合。采用ELISA方法筛选阳性的杂交瘤细胞进行3次克隆纯化,最终筛选得到稳定分泌SLA I抗体的杂交瘤细胞株MAb-1A11。经ELISA检测纯化后的MAb-1A11效价可达1:3 200,经小鼠MAb抗体亚类鉴定试剂盒鉴定其重链为IgG2b,轻链为κ。采用western blot检测该抗体的特异性,结果显示,MAb-1A11能够识别猪肺泡巨噬细胞(PAM)表达的内源性SLA I,在42 ku处出特异性条带,而对HEK293T细胞中表达的同源物人白细胞抗原无交叉识别作用。利用MAb-1A11为一抗,采用western blot进一步检测非洲猪瘟病毒(ASFV)HLJ/18-6GD株感染的PAM中SLA I的表达水平,结果显示,随着ASFV感染时间的延长,SLA I表达水平出现轻微下降。本研究制备了SLA I的MAb,并初步将其应用于ASFV感染机制的研究中,为深入了解SLA I所受调控的机制提供了可靠工具。 展开更多
关键词 猪白细胞抗原I 单克隆抗体 WESTERNBLOT 非洲猪瘟病毒
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结核分枝杆菌蛋白酶Rv1487对宿主免疫反应作用的研究
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作者 陈春文 姜艳艳 +10 位作者 郭若男 段祎凡 高云洁 张镇钧 冯婷婷 王慧 李梦雨 聂蝉蝉 崔莹莹 党光辉 刘思国 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第7期721-730,共10页
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种重要人兽共患传染病,现有的卡介苗无法对MTB感染提供有效的免疫保护。为探寻更有效的MTB保护性抗原,本团队前期通过生物信息学软件分析发现MTB Rv1487蛋白具有蛋白酶活性。为研究Rv1487蛋白酶对... 结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种重要人兽共患传染病,现有的卡介苗无法对MTB感染提供有效的免疫保护。为探寻更有效的MTB保护性抗原,本团队前期通过生物信息学软件分析发现MTB Rv1487蛋白具有蛋白酶活性。为研究Rv1487蛋白酶对宿主免疫反应的影响,本研究采用噬菌体介导的同源重组方法构建rv1487基因缺失株ΔRv1487和回补株ΔRv1487+Rv1487,并经PCR与southern blot鉴定正确后,将ΔRv1487与ΔRv1487+Rv1487株连续传5代,PCR鉴定结果显示,ΔRv1487+Rv1487株出现约345 bp的目的条带,ΔRv1487株则无该条带;Southern blot鉴定结果显示,经Bam H I酶切后H37Ra与ΔRv1487株分别出现4.3 kb与7.6 kb的目的条带,经Nhe I酶切后上述两株菌分别出现5.6 kb和8.9 kb的目的条带。传5代后回补株出现约435 bp的目的条带,缺失株则无该目的条带。表明正确构建了遗传稳定性较好的rv1487基因缺失株和回补株。通过检测各菌液OD_(600nm)值绘制生长曲线,利用H37Ra菌株感染小鼠和人巨噬细胞后不同时间通过qPCR检测细胞中rv1487基因的相对转录水平,将H37Ra、ΔRv1487和ΔRv1487+Rv1487株分别感染巨噬细胞12 h和24 h,通过qPCR检测促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)基因的相对转录水平;感染后12 h、24 h和48 h,分别采用qPCR检测细菌在巨噬细胞胞内的定植量。生长曲线测定结果显示,各菌株的生长速度基本一致;qPCR检测结果显示,与未感染H37Ra的巨噬细胞相比,感染后72 h该细胞中rv1487基因的转录水平显著升高(P<0.05),感染后不同时间人巨噬细胞中rv1487基因的转录水平均极显著升高(P<0.01和P<0.001);感染后12 h和24 h,ΔRv1487株感染的细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的转录水平均显著和极显著低于H37Ra和ΔRv1487+Rv1487株感染的细胞(P<0.05、P<0.01和P<0.001)。感染后24 h和48 h,ΔRv1487株感染细胞中的细菌数显著高于H37Ra菌株感染的细胞(P<0.05);感染后12 h和24 h,ΔRv1487株感染细胞中的细菌数显著和极显著高于ΔRv1487+Rv1487株感染的细胞(P<0.05、P<0.001)。以上结果表明,Rv1487蛋白酶参与MTB的感染过程,促进促炎细胞因子的转录并增强Th1及Th17细胞免疫应答,抑制MTB在巨噬细胞内的定植。本研究为MTB候选抗原蛋白的筛选及结核病疫苗的研究提供参考依据。 展开更多
关键词 Rv1487 蛋白酶 结核分枝杆菌 巨噬细胞 免疫反应
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小鼠tfeb基因对巨噬细胞自噬功能影响的研究
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作者 张镇钧 冯婷婷 +8 位作者 聂蝉蝉 段祎凡 陈春文 郭若男 高云洁 李梦雨 崔莹莹 党光辉 刘思国 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第6期614-622,共9页
转录因子EB(TFEB)作为自噬的主要转录调节因子,通过调控细胞自噬体和溶酶体相关基因的表达影响自噬的发生。为研究TFEB在结核分枝杆菌(MTB)介导细胞自噬中的作用,本实验采用CRISPR/Cas9原理构建重组质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP-tfeb,并测序... 转录因子EB(TFEB)作为自噬的主要转录调节因子,通过调控细胞自噬体和溶酶体相关基因的表达影响自噬的发生。为研究TFEB在结核分枝杆菌(MTB)介导细胞自噬中的作用,本实验采用CRISPR/Cas9原理构建重组质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP-tfeb,并测序鉴定正确后电转化小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞,简写为WT细胞),经流式细胞仪筛选GFP阳性单克隆细胞,经PCR及western blot鉴定,将鉴定正确的细胞连续传10代,每隔3代均经western blot鉴定。结果显示,经流式细胞术共筛选到25株出现绿色荧光的单克隆细胞,对这些细胞纯化后经PCR鉴定并测序结果显示,仅一株单克隆细胞敲除tfeb中PAM序列(AGG)前的第3位碱基;western blot鉴定结果显示,相比正常细胞,该细胞无57 ku的特异性条带,且每隔3代该细胞均无该57 ku的特异性条带,表明tfeb基因缺失细胞系Δtfeb RAW264.7正确构建,且其遗传稳定性较强。将MTB H37Ra株分别感染WT细胞和Δtfeb RAW264.7细胞,12 h后经western blot检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-II和溶酶体相关膜糖蛋白1(LAMP1)的表达水平,通过RT-qPCR检测自噬相关基因maplc3、ctsb、lamp1、tpp1的转录水平,采用激光共聚焦试验检测TFEB对H37Ra诱导细胞自噬流形成的影响。Western blot和RT-qPCR结果显示,与未感染的两种细胞相比,H37Ra菌株感染的WT细胞中LC3-II和LAMP1蛋白的表达量均极显著升高(P<0.01、P<0.001);自噬相关基因maplc3和溶酶体相关基因lamp1、ctsb和tpp1的转录水平均显著和极显著升高(P<0.05、P<0.01)。H37Ra菌株感染的Δtfeb RAW264.7细胞中上述两种蛋白的表达量均无显著差异,其上述两种蛋白的表达水平均低于WT细胞且该细胞中上述自噬体和溶酶体相关基因的转录水平均无显著差异。激光共聚焦试验结果显示,与WT细胞相比,H37Ra株感染的WT细胞中黄色荧光(成熟自噬体)和红色荧光(溶酶体)的数量均极显著增加(P<0.01),且自噬流通畅,表明WT细胞发生了自噬;H37Ra株感染的Δtfeb RAW264.7细胞与未感染的该细胞中二者的荧光数量均无显著差异,且二者荧光的数量均比WT细胞整体降低,自噬流受阻。上述结果表明,本研究构建了tfeb基因稳定缺失的细胞系Δtfeb RAW264.7,且首次证实TFEB是MTB介导巨噬细胞自噬的关键宿主因子,在巨噬细胞自噬过程中发挥关键作用,本研究为深入探究TFEB在MTB介导巨噬细胞自噬中的作用提供了细胞模型和参考依据。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 转录因子EB蛋白 自噬 结核分枝杆菌
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非洲猪瘟病毒减毒活疫苗研究进展
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作者 牛鑫鑫 沈冬冬 +2 位作者 李芳 步志高 赵东明 《宁夏农林科技》 2025年第1期5-21,50,共18页
非洲猪瘟(ASF)是非洲猪瘟病毒(ASFV)感染野猪或家猪引起的一种急性、高度接触性的烈性动物传染病。ASFV传染性强、发病率高、急性感染死亡率可高达100%,是目前对全球养猪行业最具威胁性的疫病之一。由于减毒活疫苗在免疫保护效力方面的... 非洲猪瘟(ASF)是非洲猪瘟病毒(ASFV)感染野猪或家猪引起的一种急性、高度接触性的烈性动物传染病。ASFV传染性强、发病率高、急性感染死亡率可高达100%,是目前对全球养猪行业最具威胁性的疫病之一。由于减毒活疫苗在免疫保护效力方面的突出优势,被认为是短周期内最有希望的ASF疫苗。总结了ASF减毒活疫苗的研究进展,重点介绍基于病毒基因组复制必需基因缺失、多基因家族(MGF)基因缺失、介导红细胞吸附基因缺失、其他ASFV功能基因缺失,以及多毒力基因联合缺失等方向的ASF基因缺失候选疫苗研究成果,以期为ASF减毒活疫苗研究提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 非洲猪瘟病毒 疫苗
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猪病毒性腹泻有效防控——生猪产业无法回避的现实问题 被引量：2
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作者 冯力 石达 《猪业科学》 2024年第4期40-43,共4页
猪病毒性腹泻并不是一种传染病,而是一大类感染消化道病毒病的统称,因其临床症状均导致腹泻而得来,其病源包括4种猪肠道冠状病毒和猪轮状病毒(PoRV)。猪肠道冠状病毒主要包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔... 猪病毒性腹泻并不是一种传染病,而是一大类感染消化道病毒病的统称,因其临床症状均导致腹泻而得来,其病源包括4种猪肠道冠状病毒和猪轮状病毒(PoRV)。猪肠道冠状病毒主要包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和新发的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)。 展开更多
关键词 猪病毒性腹泻 猪肠道 猪德尔塔冠状病毒 生猪产业 有效防控 腹泻综合征 临床症状 病毒病
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一株鸭源H1N4亚型禽流感病毒的遗传演化分析及其对小鼠的感染性研究
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作者 崔鹏飞 颜成 +8 位作者 林维鹏 王丛丛 王燕 陈源 缪葭皓 朱春成 施建忠 邓国华 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期1215-1221,共7页
为了解2023年分离自我国广东省家鸭H1N4亚型禽流感病毒(AIV)GD/S1385株的生物学特性,本研究利用一步法RT-PCR扩增GD/S1385株全基因组,并利用二代测序平台对其全基因组测序。在GISAID数据库中经BLAST比对,并下载所有H1N4亚型AIV的全基因... 为了解2023年分离自我国广东省家鸭H1N4亚型禽流感病毒(AIV)GD/S1385株的生物学特性,本研究利用一步法RT-PCR扩增GD/S1385株全基因组,并利用二代测序平台对其全基因组测序。在GISAID数据库中经BLAST比对,并下载所有H1N4亚型AIV的全基因组序列。利用MegAlign软件分析GD/S1385株与其他H1N4亚型AIV各基因节段的同源性,采用MEGA7.0软件构建GD/S1385株与上述AIV各基因节段的进化树,采用GISAID数据库中的FluSurver程序分析GD/S1385株各基因节段关键氨基酸位点的变异。BLAST比对结果显示,H1N4亚型AIV GD/S1385株与鸡源H5N1亚型AIV NP基因序列的同源性最高为99.2%,其他基因节段分别与H1N1、H4N2、H6N2、H8N4和H10N4等野鸟源AIV相应基因序列的同源性最高达98.2%~99.8%。同源性分析结果显示,GD/S1385株与GISAID数据库中12株H1N4 AIV HA和NA基因序列的同源性分别为84.3%~91.8%和83.2%~97.5%,内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因序列的同源性分别为86.6%~94.8%、89%~95.6%、88.4%~95.1%、88%~94.4%、92.5%~96.2%和71.1%~93.4%。进化树结果显示,GD/S1385株部分基因节段与野鸟源H1N1、H4N2、H5N1、H6N2、H8N4和H10N4等亚型AIV处于同一进化分支,但与H1N4亚型AIV的遗传距离均较远。序列分析结果显示,GD/S1385株HA蛋白裂解位点氨基酸序列为^(323)PSIQSRGL^(330),符合低致病性禽流感病毒(LPAIV)的分子特征;NA蛋白未发生茎部缺失,也未出现神经氨酸酶抑制剂类药物的耐药性突变;PB2蛋白出现^(389)R、^(598)T,PB1蛋白出现^(3)V、^(622)G,PA蛋白出现^(37)A、^(409)S,NP蛋白出现^(105)V,NS1蛋白出现106M等多个哺乳动物适应性的氨基酸突变位点。将GD/S1385株以10^(6)EID_(50)/50μL经鼻腔感染BALB/c小鼠,评估病毒对哺乳动物的感染性。结果显示,GD/S1385株感染组小鼠的肺脏和鼻甲内均可检测到高水平的病毒,病毒滴度分别为6.1log_(10)EID_(50)/mL和3.6log_(10)EID_(50)/mL;在1只小鼠的肾脏和脾脏内还检测到低水平的病毒,脑内未检测到病毒;且可引起感染组小鼠体质量下降8.2%。对照组小鼠各脏器均未检测到病毒,且体质量呈一直上升趋势。上述结果表明,H1N4 AIV GD/S1385株是一种新型重组病毒,具有明显的遗传多样性,并可以在小鼠的呼吸道内高效复制,具有感染哺乳动物和人类的潜在风险。本研究阐明了H1N4亚型AIV的遗传进化特点和对哺乳动物的感染风险,为禽流感的监测和综合防控提供了数据支持。 展开更多
关键词 H1N4亚型禽流感病毒 遗传进化 感染性
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猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究 被引量：6
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作者 曾苗苗 刘大凯 +8 位作者 张记宇 张燎原 冯廷帅 杨小曼 时洪艳 张鑫 陈建飞 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期61-69,共9页
为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证... 为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID_(50))测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)则均显著升高(P<0.05)。针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 si RNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05)。本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及防控该病毒的感染奠定了基础。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 自噬 病毒复制 LC3-Ⅱ
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表达2.3.4.4b分支H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸭瘟病毒的构建及其免疫保护效力的研究 被引量：1
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作者 张小雨 刘静 +8 位作者 赵玉博 焦晨晨 麻琦 陈普泽 谢艳 陈普成 姜永萍 陈化兰 柳金雄 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1049-1056,共8页
近年来,2.3.4.4b分支H5亚型禽流感病毒(AIV)引起的禽流感疫情在全球多国暴发,切断水禽作为AIV传播媒介的途径对于禽流感的防控意义重大。为研制针对当前H5亚型AIV流行株和鸭瘟病毒(DEV)感染均具有免疫保护作用的疫苗,本研究经PCR扩增2.3... 近年来,2.3.4.4b分支H5亚型禽流感病毒(AIV)引起的禽流感疫情在全球多国暴发,切断水禽作为AIV传播媒介的途径对于禽流感的防控意义重大。为研制针对当前H5亚型AIV流行株和鸭瘟病毒(DEV)感染均具有免疫保护作用的疫苗,本研究经PCR扩增2.3.4.4b分支H5亚型AIV HA基因,按照文献方法构建以DEV疫苗株为载体,表达2.3.4.4b分支H5亚型AIV代表株A/whooper swan/Shanxi/4-1/2020(H5N8)HA基因的重组DEV,命名为rDEV-14株。将rDEV-14株在CEF中连续传代后,经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测,并检测各培养时间rDEV-14株的TCID_(50),分析其生长特性。结果显示,在10、15代rDEV-14的PCR产物中检测到HA基因,IFA和western blot检测结果显示HA基因可在rDEV-14株各代中稳定遗传和表达。生长曲线测定结果显示rDEV-14株在CEF中的生长曲线与亲本病毒DEV疫苗株趋势一致。以不同剂量rDEV-14株免疫4月龄SPF鸭14 d后,采用DEV强毒AV1221株攻毒,结果显示,各剂量rDEV-14株均可诱导SPF鸭对DEV感染的完全免疫保护。以不同剂量rDEV-14株免疫2周龄SPF鸭后,分别利用同源和2021年~2022年分离的H5亚型异源高致病性AIV(HPAIV)(H5N6及两株H5N1 AIV)攻毒后记录各组鸭发病和死亡情况、检测排毒情况和HI抗体,结果显示,10^(4)TCID_(50)和10~5TCID_(50)免疫组鸭在攻毒后两周内无发病、无死亡、不排毒,并可诱导鸭产生良好且持久的HI抗体。上述结果表明本研究制备的重组病毒r DEV-14可对DEV强毒、同源H5亚型AIV强毒以及2021年~2022年分离的H5N1和H5N6异源HPAIV攻毒鸭产生完全的免疫保护力。本研究为我国水禽禽流感和鸭瘟的防控提供了新的候选疫苗株。 展开更多
关键词 鸭瘟 H5亚型禽流感病毒 重组鸭瘟病毒 活载体疫苗
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病毒靶向抗原递呈细胞调控细胞免疫应答的研究进展 被引量：1
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作者 侯青荷 李树稳 +2 位作者 高旭 李永锋 仇华吉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期869-875,共7页
细胞免疫是参与免疫应答的细胞之间相互作用从而发挥免疫功能。细胞免疫应答是机体抵御外来病原体侵袭的重要防线,在免疫保护中发挥着重要作用。然而,许多病毒通过靶向抗原递呈细胞抑制或逃避细胞免疫来实现其在宿主体内的复制。因此,... 细胞免疫是参与免疫应答的细胞之间相互作用从而发挥免疫功能。细胞免疫应答是机体抵御外来病原体侵袭的重要防线,在免疫保护中发挥着重要作用。然而,许多病毒通过靶向抗原递呈细胞抑制或逃避细胞免疫来实现其在宿主体内的复制。因此,本文主要针对细胞免疫应答的作用及其主要过程、参与调控细胞免疫应答的抗原递呈细胞及其机制的最新研究进展进行了概述,为深入研究病毒调控细胞免疫应答的机制提供思路并为设计基于细胞免疫应答的新型疫苗提供参考。 展开更多
关键词 细胞免疫应答 免疫保护 抗原递呈细胞 免疫功能 新型疫苗 最新研究进展 病毒 靶向
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敲除CRFK细胞氨基肽酶N对猫传染性腹膜炎病毒复制影响的研究 被引量：1
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作者 陈晓彤 郭慧娟 +6 位作者 田进 王洪峰 史鑫琪 陈洪岩 夏长友 王金泉 孟庆文 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期306-313,共8页
猫氨基肽酶N(fAPN)参与猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的感染过程,为研究f APN对FIPV复制的影响,本研究针对f APN第14外显子设计了1对sg RNA,将sg RNA退火后克隆至p X458质粒中,构建同时含有Cas9蛋白和sg RNA的重组质粒。重组质粒经PCR及测... 猫氨基肽酶N(fAPN)参与猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的感染过程,为研究f APN对FIPV复制的影响,本研究针对f APN第14外显子设计了1对sg RNA,将sg RNA退火后克隆至p X458质粒中,构建同时含有Cas9蛋白和sg RNA的重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,瞬时转染猫肾细胞(CRFK)中,24 h后通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的单克隆细胞。单克隆细胞经稳定传代培养后,细胞中的绿色荧光消失,对细胞进行PCR和测序,结果显示:3株单克隆细胞在f APN第14外显子有1个碱基的插入,造成移码突变,导致f APN不能正常表达,表明敲除f APN蛋白的CRFK细胞系正确构建,命名为KO-APN14。将FIPV分别感染CRFK细胞及培养20代的KO-APN14细胞,48 h后通过间接免疫荧光试验(IFA)检测FIPV N蛋白的表达;将FIPV分别感染CRFK细胞及KO-APN14细胞,在感染4 h、12 h、24 h、36 h时采用RT-q PCR分别检测FIPV N基因、视黄酸(维甲酸)诱导基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、Toll样受体3(TLR3)、干扰素β(IFN-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)的转录水平。IFA结果显示:感染FIPV的CRFK细胞出现绿色荧光,未感染FIPV的CRFK细胞、未感染FIPV的KO-APN14细胞及感染FIPV的KO-APN14细胞均无绿色荧光;RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后病毒N基因的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够极显著抑制FIPV N基因的转录(P<0.0001);RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后上述各细胞因子的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够抑制RIG-I、MDA5、TLR3、IFN-β、IL-6、IL-10、TNF-α及f APN的转录。综上所述,f APN是FIPV在侵入细胞及病毒复制过程中发挥重要作用,并在FIPV引起的炎症反应过程中起关键作用。本研究为f APN在免疫炎症反应中作用的研究提供科学依据,并为培育基因编辑抗病育种猫奠定实验基础。 展开更多
关键词 氨基肽酶N 猫传染性腹膜炎病毒 猫肾细胞
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2型猪链球菌pnp基因缺失株与回补株的构建及其生物学特性的研究 被引量：6
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作者 杨文琳 许秋 +6 位作者 周龙玉 林龙华 柴霁芸 马彩萍 侯杰 祝瑶 张万江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期221-228,共8页
为研究2型猪链球菌(SS2) pnp基因的生物学功能,本研究通过基因无痕操作技术构建SS2 05ZYH33pnp基因缺失株Δpnp以及回补株CΔpnp,经PCR和测序鉴定结果表明,正确构建了pnp基因无痕缺失株和回补株。将05ZYH33、Δpnp以及CΔpnp分别在不同... 为研究2型猪链球菌(SS2) pnp基因的生物学功能,本研究通过基因无痕操作技术构建SS2 05ZYH33pnp基因缺失株Δpnp以及回补株CΔpnp,经PCR和测序鉴定结果表明,正确构建了pnp基因无痕缺失株和回补株。将05ZYH33、Δpnp以及CΔpnp分别在不同温度(28℃、37℃、42℃)培养后测定OD_(600nm)值,绘制各菌株的生长曲线;利用革兰氏染色后经镜检及透射电镜观察各菌株的形态结构;通过滴定微孔平板结晶紫法检测各菌株的生物被膜形成能力;采用接触法分析各菌株的溶血特性;于含不同抗生素的THB平板上培养各菌株,分析各菌株的药物敏感性;于氧化条件与酸性条件下培养各菌株,通过统计存活率评价各菌株的氧化耐受与酸耐受能力。结果显示,缺失株的生长速率明显低于野生株和回补株,且在冷应激条件下的生存能力下降;与野生株和回补株相比,缺失株细胞壁肽聚糖层的结构更加松散、溶血能力下降、生物被膜形成能力下降、对不同类型抗生素的敏感性增强、抗氧化与抗酸能力均下降。上述结果表明pnp基因是SS2的一个重要调节因子,参与调节细菌对外界环境变化的适应能力。本研究为科学防控猪链球菌病以及研发新型抗菌药物奠定基础。 展开更多
关键词 2型猪链球菌 pnp基因 基因缺失 生物学功能
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