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猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用
被引量：
6
1
作者
刘大凯
韩郁茹
+8 位作者
张记宇
张燎原
冯廷帅
杨小曼
曾苗苗
时洪艳
秦毅斌
石达
冯力
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第5期499-504,共6页
为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和...
为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示,r S1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染,为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。
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关键词
猪急性腹泻综合征冠状病毒
S蛋白
原核表达
多克隆抗体
初步应用
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猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用
被引量：
6
1
作者
刘大凯
韩郁茹
张记宇
张燎原
冯廷帅
杨小曼
曾苗苗
时洪艳
秦毅斌
石达
冯力
机构
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国家重点实验室
广西
兽医
研究所
广西
兽医
生物技术
重点
实验室
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第5期499-504,共6页
基金
广西兽医生物技术重点实验室开放基金(22-035-32-B-01)
中国农业科学院基本科研业务费(1610302022015)
国家重点研发计划(2021YFD1801105)。
文摘
为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示,r S1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染,为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。
关键词
猪急性腹泻综合征冠状病毒
S蛋白
原核表达
多克隆抗体
初步应用
Keywords
swine acute diarrhea syndrome coronavirus
S protein
prokaryotic expression
polyclonal antibody
preliminary application
分类号
S852.65 [农业科学—基础兽医学]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用
刘大凯
韩郁茹
张记宇
张燎原
冯廷帅
杨小曼
曾苗苗
时洪艳
秦毅斌
石达
冯力
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024
6
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