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H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化的研究 被引量:20
1
作者 陈君彦 李海燕 +3 位作者 申之义 陈化兰 于康震 毕英佐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期13-17,共5页
对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型... 对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型SIV的HAI蛋白在 10、11、2 3、87、2 87位都存在高度保守的糖基化位点 ,此外 ,在 2 76位多了一个“_NTT_”糖基化位点 ,与参考毒株SW /IW / 93/ 0 1一致 ,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。本研究进一步发现 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因切割位点氨基酸组成为IPSIQSR↓G ,具有非高致病力毒株分子特征 ;而其受体结合位点在HA蛋白上第 2 2 6位是Q ,第 2 2 8位是G ,可能具有感染禽的潜力。经同源性比较 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因与古典型H1N1猪谱系中的WIS/ 4 75 4 / 94的同源性相对最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到 95 7%~ 96 1%和96 5 %~ 97 2 %。由同源性比较结果和进化树分析可见 。 展开更多
关键词 H1N1亚型 猪流感病毒 中国分离株 血凝素基因 分子演化 序列分析
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禽流感基因诊断技术研究进展 被引量:2
2
作者 田丽娜 王秀荣 +3 位作者 杨忠苹 石霖 陶启蒙 陈化兰 《动物医学进展》 CSCD 2008年第8期60-62,共3页
禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病,不但造成养禽业的巨大经济损失,还对人类公共卫生安全存在威胁。因此,快速、准确的基因诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。近年来,主要有RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR技术、... 禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病,不但造成养禽业的巨大经济损失,还对人类公共卫生安全存在威胁。因此,快速、准确的基因诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。近年来,主要有RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR技术、核酸依赖扩增技术(NASBA)以及基因芯片等基因诊断技术。文章就这些方法的基本原理、检测优点以及应用现状进行综述,以期为有效控制禽流感的发生与流行提供有力技术支撑。 展开更多
关键词 禽流感 反转录-聚合酶链反应 核酸依赖扩增技术 基因芯片
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两株鸭源H6N2亚型禽流感病毒的序列分析及对鸡的致病性研究 被引量:16
3
作者 丁晴微 邓国华 +7 位作者 施建忠 李印 崔鹏飞 齐瑛琳 于杨 崔佳莹 邱伯根 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期270-275,共6页
为了解鸭源H6N2亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对两株鸭源H6N2亚型AIV[A/duck/Hubei/Sd061/2008(HB/061/08)和A/duck/Fujian/S2080/2009(FJ/080/09)]进行序列分析和致病性试验。序列分析显示:两株病毒的HA和NA基因均来源于我... 为了解鸭源H6N2亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对两株鸭源H6N2亚型AIV[A/duck/Hubei/Sd061/2008(HB/061/08)和A/duck/Fujian/S2080/2009(FJ/080/09)]进行序列分析和致病性试验。序列分析显示:两株病毒的HA和NA基因均来源于我国近年流行的H6亚型病毒株,但是HB/061/08株的内部基因可能来源于H9、H5等其他亚型。与病毒株HB/061/08NP、PA、PB2基因的核苷酸同源性最高的病毒株为A/environment/Hunan/2-84/2007(H9N2);与M、PB1和NS基因的核苷酸同源性最高的病毒株分别为A/duck/Zhejiang/11/2000(H5N1)、A/chicken/Hebei/7/2008(H9N2)和A/chicken/Henan/L1/2008(H9N2)。两株病毒的抗原差异性较显著,相关系数为0.49;用106EID50病毒剂量感染4周龄SPF鸡,结果显示FJ/080/09株不能感染鸡,而HB/061/08株在鸡体内能够高效复制,并通过咽喉和泄殖腔持续排毒。鸡群感染后第3d采取脏器样品,在气管和肺部能够检测到病毒存在,部分脏器和器官的组织学观察显示存在一定程度的病理变化。以上数据表明,H6亚型AIV在跨越不同宿主感染的传播过程中,对新宿主适应能力的差异导致对其致病性的差异。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H6N2 基因组分析 抗原分析 致病性
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H5亚型禽流感病毒A/Duck/Anhui/1/2006(Clade 2.3)密码子优化HA基因DNA疫苗的免疫保护效力研究 被引量:9
4
作者 王国俊 熊杰 +6 位作者 李俊平 曾显营 田国彬 李雁冰 施建忠 姜永萍 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期116-120,共5页
为了进一步评价基于HA基因的DNA疫苗的开发应用前景,本研究将表达H5亚型禽流感水禽群代表株A/Duck/Anhui/1/2006(H5N1)[DKAH/1/06(H5N1)]HA基因的DNA疫苗pCAGGoAHHA的免疫保护效力进行了评估,以5μg、10μg、20μg、50μg和100μg剂量免... 为了进一步评价基于HA基因的DNA疫苗的开发应用前景,本研究将表达H5亚型禽流感水禽群代表株A/Duck/Anhui/1/2006(H5N1)[DKAH/1/06(H5N1)]HA基因的DNA疫苗pCAGGoAHHA的免疫保护效力进行了评估,以5μg、10μg、20μg、50μg和100μg剂量免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后3周再加强免疫一次,加强免疫后2周用106EID50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Duck/Fujian/31/2007(H5N1)[DKFJ/31/07(H5N1)]鼻腔途径进行攻毒,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3d、5d、7d天采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测攻毒鸡排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体、NT抗体的动态变化。结果,20μg、50μg、100μg组的pCAGGoAHHA均可对免疫鸡产生100%完全保护(不发病、不致死、不排毒),而5μg和10μg剂量组则可对免疫鸡分别形成25%和75%的保护。结果表明,H5亚型禽流感水禽群DNA疫苗质粒pCAGGoAHHA具有良好的免疫保护性,有望成为预防H5亚型HPAIV的技术储备候选疫苗。 展开更多
关键词 禽流感 H5亚型 水禽群 DNA疫苗 保护效力
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表达禽流感病毒H5HA、H7HA基因DNA疫苗的免疫原性研究 被引量:4
5
作者 张芳芳 姜永萍 +3 位作者 刘光亮 陈怀涛 乔传玲 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期1-5,共5页
为研究双顺反子DNA疫苗对禽流感病毒(AIV)的保护作用,将H5和H7亚型AIV的HA基因克隆到同一表达载体上,构建了双顺反子HA基因表达质粒pCI-H5HA-H7HA。以此质粒肌注免疫4周龄SPF鸡,首次免疫后3周加强免疫,同时设pCI-H5HA和pCI-H7HA联合免... 为研究双顺反子DNA疫苗对禽流感病毒(AIV)的保护作用,将H5和H7亚型AIV的HA基因克隆到同一表达载体上,构建了双顺反子HA基因表达质粒pCI-H5HA-H7HA。以此质粒肌注免疫4周龄SPF鸡,首次免疫后3周加强免疫,同时设pCI-H5HA和pCI-H7HA联合免疫组及空白对照组,每周采血用微量血凝抑制法检测HI抗体。加强免疫后3周分别以100LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/FPV/Rostock/34(H7N1)进行致死性攻击。结果显示各免疫组均可刺激鸡体产生H5、H7特异性抗体,pCI-H5HA-H7HA诱导产生的抗体对H5N1和H7N1的攻毒保护分别为50%和10%,而pCI-H5HA和pCI-H7HA联合免疫的攻毒保护均为70%。表明双顺反子质粒可诱导鸡产生较好或一定的保护,但免疫效果不够理想,推测与DNA的摄取及其体内表达有关,可望通过调整DNA疫苗的多种因素提高免疫效果。 展开更多
关键词 禽流感 H5亚型 H7亚型 HA基因 DNA疫苗
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禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定 被引量:7
6
作者 赵双成 常晓飞 +6 位作者 田石 柳金雄 陈普成 田国彬 邓国华 姜永萍 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期523-526,共4页
为研究禽流感病毒(AIV)HA蛋白抗原活性,本研究将A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的HA基因片段克隆于pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。... 为研究禽流感病毒(AIV)HA蛋白抗原活性,本研究将A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的HA基因片段克隆于pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。采用间接免疫荧光、western blot和血凝试验对所表达的蛋白进行抗原性和生物学活性分析。结果表明,表达重组蛋白分子量约为64 ku;IFA和western blot试验证明重组HA蛋白能够与H5亚型禽流感阳性血清特异结合,具有良好的抗原性;血凝试验和淋巴细胞增殖试验显示重组蛋白具有良好生物学活性。重组蛋白的正确表达为进一步研究HA基因功能活性和制备禽流感HA基因亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 禽流感 HA基因 杆状病毒
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3株H3N8亚型禽流感病毒对SPF鸡和Balb/c小鼠致病性研究 被引量:5
7
作者 谭丹 关立铮 +7 位作者 王晶 崔鹏飞 施建忠 黄建龙 何世成 王昌建 刘道新 邓国华 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第4期77-80,共4页
为了解从洞庭湖区鸭子和环境中分离的3株H3N8亚型禽流感病毒的致病性。利用这3株毒株对SPF鸡及Balb/c小鼠进行致病性试验,结果显示,3株毒株均能使鸡感染并排毒,但不引起鸡明显的临床症状及死亡,感染鸡后第3天~第7天在泄殖腔排出... 为了解从洞庭湖区鸭子和环境中分离的3株H3N8亚型禽流感病毒的致病性。利用这3株毒株对SPF鸡及Balb/c小鼠进行致病性试验,结果显示,3株毒株均能使鸡感染并排毒,但不引起鸡明显的临床症状及死亡,感染鸡后第3天~第7天在泄殖腔排出高滴度病毒,且持续至第11天(仅观察到该天),与以往的研究相比,排毒时间更长。3株H3N8亚型毒株感染小鼠后,能在小鼠鼻甲及肺脏内高滴度复制,但小鼠的体重变化不明显。结果说明3株H3亚型AIV对家禽及哺乳动物感染能力增强,因此加强该亚型的流行病学监测及致病性的研究非常重要。 展开更多
关键词 H3N8亚型禽流感病毒 致病性 SPF鸡 BALB C小鼠
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两株H4N3禽流感病毒全基因组序列分析及对小鼠的致病性研究 被引量:4
8
作者 张文亮 张曦 +5 位作者 朱占松 谭丹 崔鹏飞 施建忠 邓国华 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期266-269,共4页
2009年在我国南方活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到2株H4N3亚型禽流感病毒(AIV),DK/FJ/S1419/09(H4N3)(FJ/419/2009)和DK/HUN/S1010/09(H4N3)(HuN/010/2009)。为了解这2株H4N3亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行全基因... 2009年在我国南方活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到2株H4N3亚型禽流感病毒(AIV),DK/FJ/S1419/09(H4N3)(FJ/419/2009)和DK/HUN/S1010/09(H4N3)(HuN/010/2009)。为了解这2株H4N3亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行全基因组分析及对小鼠致病性研究。结果显示:其HA基因来源于近两年流行的H4亚型病毒株,NA基因来源于其它亚型病毒株。内部基因来源较复杂,与FJ/419/2009内部基因同源性最高的病毒株均来自国内H5、H6等亚型分离株,但与HuN/010/2009同源的内部基因则差异较大,与PA、M和NS同源性最高的病毒株分别为A/wild/duck/Korea/UP122/2007(H1N1),A/muscovy/duck/Thailand/CU-LM1983/2009(H4N6)and A/avian/Japan 8KI0068/2008(H3N6)。用106EID50病毒剂量感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示试验组小鼠感染后第3 d采脏器样品,仅在鼻甲和肺部能检测到病毒存在。以上数据表明,尽管这2株H4N3特殊亚型组合病毒来源复杂,但对小鼠的致病性较低。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H4亚型 基因组分析 致病性
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含有鸡体偏嗜性密码子的H5亚型禽流感病毒HA基因的优化构建及其DNA疫苗体外瞬时表达研究 被引量:3
9
作者 姜永萍 李呈军 +5 位作者 张洪波 步志高 张芳芳 邓国华 于康震 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期441-444,449,共5页
不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒的密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的表达A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA蛋白... 不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒的密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的表达A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA蛋白的基因optiHA5,并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA5,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质粒pCIHA5和pCIoptiHA5分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24~48h293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Westemblot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的基因optiHA5体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因.这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础. 展开更多
关键词 H5亚型禽流感病毒 HA基因 DNA疫苗 鸡体偏嗜性密码子 偏嗜性 寡核苷酸
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A型流感病毒聚合酶研究进展 被引量:5
10
作者 葛叶 邓国华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期161-164,共4页
A型流感病毒(Influenza A virus,IV)基因组为单负链线状分节段RNA,总长约13600个核苷酸(nt)。根据襄膜上血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同,可分为16个H亚型(H1~H16)和9个N亚型(N1~N9)。A型流感病毒可突破种问... A型流感病毒(Influenza A virus,IV)基因组为单负链线状分节段RNA,总长约13600个核苷酸(nt)。根据襄膜上血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同,可分为16个H亚型(H1~H16)和9个N亚型(N1~N9)。A型流感病毒可突破种问障碍适应新的宿主,从而导致新的血清型毒株流行。1918年、1957年和1968年3次大规模流感疫病的暴发,给人们敲响了警钟。在此背景下,疫苗不断更新、预防流感病毒的药物相继问世, 展开更多
关键词 A型流感病毒 聚合酶 VIRUS 神经氨酸酶 RNA 基因组 核苷酸 抗原性
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AIV血凝素亚型同步检测基因芯片技术研究 被引量:1
11
作者 王秀荣 刘丽玲 +5 位作者 包红梅 乔传玲 王煜 孙凯 孔宪刚 陈化兰 《生物技术通报》 CAS CSCD 2006年第C00期260-263,271,共5页
对流感病毒14个血凝素亚型的基因芯片检测技术进行了初步研究。通过RT-PCR克隆禽流感病毒血凝素基因片段,获得重组质粒。从重组质粒扩增大约500bp的DNA片段,浓缩后点到氨基化玻璃载体上,制成芯片。待检病毒样品用TRIzolLS提取RNA,反转... 对流感病毒14个血凝素亚型的基因芯片检测技术进行了初步研究。通过RT-PCR克隆禽流感病毒血凝素基因片段,获得重组质粒。从重组质粒扩增大约500bp的DNA片段,浓缩后点到氨基化玻璃载体上,制成芯片。待检病毒样品用TRIzolLS提取RNA,反转录过程中用Cy5标记样品cDNAs。将标记样品与芯片杂交,扫描芯片上待检样品与芯片上捕捉探针的结合位点,杂交信号与预期设想一致。结果显示,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV血凝素亚型鉴别诊断方法。 展开更多
关键词 禽流感病毒 基因芯片 血凝素亚型鉴定 AIV
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H5亚型禽流感DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭免疫保护效力的研究 被引量:1
12
作者 李俊平 赵双成 +6 位作者 常晓飞 柳金雄 曾显营 卫星辉 李福基 姜永萍 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期211-213,共3页
为评价H5亚型禽流感病毒(AIV)DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭的免疫保护效力,本研究将pCAGGoptiHA5以20μg、30μg和50μg剂量免疫3周龄SPF鸭,首次免疫后3周加强免疫一次。2周后以105EID50的鸭源高致病力AIV由鼻腔攻毒,观察SPF鸭发病和死亡情... 为评价H5亚型禽流感病毒(AIV)DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭的免疫保护效力,本研究将pCAGGoptiHA5以20μg、30μg和50μg剂量免疫3周龄SPF鸭,首次免疫后3周加强免疫一次。2周后以105EID50的鸭源高致病力AIV由鼻腔攻毒,观察SPF鸭发病和死亡情况。分别于攻毒后3d、5d和7d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离,检测鸭排毒情况及免疫和攻毒后血凝抑制(HI)抗体、中和(NT)抗体的动态变化。结果表明:30μg和50μg免疫组均可对免疫鸭产生100%保护,而20μg剂量组则可对免疫鸭提供80%保护。 展开更多
关键词 禽流感 DNA疫苗 pCAGGoptiHA5
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A型流感病毒M2蛋白研究进展 被引量:4
13
作者 万春和 刘明 《动物医学进展》 CSCD 2007年第7期56-60,共5页
M2蛋白是A型流感病毒所特有的一种结构保守的非糖基化的跨膜蛋白,主要在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境,在表面血凝素糖蛋白合成过程中作为质子通道调节高尔基体跨膜转移通道的pH。其核苷酸序列高度保守,几乎不发生变异。其25位~43... M2蛋白是A型流感病毒所特有的一种结构保守的非糖基化的跨膜蛋白,主要在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境,在表面血凝素糖蛋白合成过程中作为质子通道调节高尔基体跨膜转移通道的pH。其核苷酸序列高度保守,几乎不发生变异。其25位~43位氨基酸多肽是金刚烷胺类抗流感病毒药物的作用靶位,氨基酸极小变异都可能导致流感病毒抗药性的产生。M2蛋白胞外区域的氨基酸残基多肽(M2e)的特异性抗体可以在感染流感病毒的动物血清中检测出来,将M2e与相关佐剂联合使用可极大的提高机体对流感病毒的免疫力,在病毒感染中起重要作用,是一种潜在的交叉保护性抗原,常被用来探索具有广谱性和持久性的流感"通用疫苗"。 展开更多
关键词 A型流感病毒 M2蛋白 疫苗
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H6N2亚型禽流感病毒全基因组的序列分析及其致病性研究
14
作者 刘丽玲 胡守萍 +5 位作者 段振华 李雁冰 施建忠 田国彬 曾显营 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期870-873,共4页
2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定出1株H6N2亚型禽流感病毒(AIV)。为了解该病毒DK/GD/S6/08(H6N2)的生物学特征,本研究对其全基因序列进行分析并对SPF鸡和SPF鸭进行致病性试验。结果表明DK/GD/S6/08(H6N2)... 2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定出1株H6N2亚型禽流感病毒(AIV)。为了解该病毒DK/GD/S6/08(H6N2)的生物学特征,本研究对其全基因序列进行分析并对SPF鸡和SPF鸭进行致病性试验。结果表明DK/GD/S6/08(H6N2)的HA裂解位点附近的氨基酸序列为340QIETR↓GLF347,符合低致病力AIV的特征。其HA基因与A/duck/Shantou/8365/2005(H6N6)同源性最高;NA基因在颈部无缺失;除M基因外,其他5个内部基因均来源于H6亚型AIV。鸭致病性试验表明DK/GD/S6/08(H6N2)可以感染SPF鸭,并通过泄殖腔排毒,法氏囊等脏器中可以检测到病毒,肺脏、肾脏、法氏囊和脑组织中可见病理变化。鸡致病性试验显示鸡的脑、肺脏、脾脏、法氏囊、肾脏、十二指肠和胰腺均未检测到病毒,咽喉拭子和泄殖腔拭子中未检测到病毒,表明该病毒不能感染SPF鸡。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H6N2亚型 序列分析 致病性
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H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/2/2005活候选疫苗株的构建及其对鸡致病性的研究
15
作者 樊树芳 许传田 +1 位作者 索永兵 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期831-835,共5页
A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗供体株具有冷适应性、温度敏感性和致弱性表型。本研究利用基因工程技术体外合成A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗株具有冷适应性的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS,从A/Anhui/2/2005(H5N1)毒株... A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗供体株具有冷适应性、温度敏感性和致弱性表型。本研究利用基因工程技术体外合成A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗株具有冷适应性的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS,从A/Anhui/2/2005(H5N1)毒株获得HA、NA,并对HA基因上的多个连续碱性氨基酸基序进行了缺失修饰。将上述8个基因片段分别克隆至pBD双向表达载体中测序鉴定。利用质粒反向遗传操作系统,将构建正确的8个重组pBD质粒转染Vero细胞拯救病毒。经RT-PCR和序列测定鉴定,结果表明本试验成功获得了一株H5N1亚型A/Anhui/2/2005重组病毒,将其命名为AH/AAca,救获的重组病毒具有预期的温度敏感性和冷适应性生物学特性。随后进行了AH/AAca人工感染SPF鸡的感染性和致病性试验,结果表明其对鸡既无感染性,也无致病性。AH/AAca的获得为评价其在小鼠、非人类灵长目等动物模型上的保护效力的研究打下了坚实基础,为我国预防人禽流感的流行建立了技术储备。 展开更多
关键词 禽流感病毒 反向遗传操作 救获病毒 冷适应性 温度敏感性
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两株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导细胞凋亡的研究 被引量:3
16
作者 余丹丹 邓国华 +1 位作者 张书霞 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期295-298,共4页
为了研究H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导的细胞凋亡作用,我们将两株H5N1亚型禽流感病毒A/Duck/Guangdong/40/2000(H5N1)(简称DKGD/40/00)和A/Duck/Guangxi/35/2001(H5N1)(简称DKGX/35/01)的NS1基因克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP,转染H... 为了研究H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导的细胞凋亡作用,我们将两株H5N1亚型禽流感病毒A/Duck/Guangdong/40/2000(H5N1)(简称DKGD/40/00)和A/Duck/Guangxi/35/2001(H5N1)(简称DKGX/35/01)的NS1基因克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP,转染Hela细胞后,应用荧光显微镜检测转染表达效率,应用TUNEL和流式细胞仪观察NS1基因产生的细胞凋亡作用。结果两株病毒NS1蛋白表达均能诱导Hela细胞凋亡,凋亡率无明显差异。表明单一的NS1并不能完全阐明凋亡的产生与病毒毒力强弱和病毒扩散之间的关系。 展开更多
关键词 禽流感病毒 NSI基因 细胞凋亡
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SYBR Green I荧光RT-PCR方法检测禽流感病毒 被引量:13
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作者 刘丽玲 姜永萍 +2 位作者 王秀荣 陈化兰 魏萍 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期1189-1193,共5页
为建立检测禽流感病毒(AIV)的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞,收集感染6、12、24、48、72 h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基... 为建立检测禽流感病毒(AIV)的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞,收集感染6、12、24、48、72 h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基因进行检测,试图建立快速检测AIV的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,并与普通RT-PCR方法和传统的病毒滴定方法进行比较。结果表明:此次建立的检测AIV的SYBRGreen I荧光RT-PCR方法能检测到感染MDCK细胞后72 h的AIV,对169份泄殖腔拭子和咽喉拭子中的AIV检出率为5.33%(9/169),而普通RT-PCR方法检出率为6.51%(11/169),病毒滴定检出率为5.62(9/160)。对其他病毒(NDVI、BDVI、BV、VA)则未检测到,且整个检测过程只需4 h,表明该方法特异、准确、快速。 展开更多
关键词 禽流感病毒 SYBR Green RT—PCR RT—PCR 病毒滴定 检测
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猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立 被引量:23
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作者 杨焕良 乔传玲 +3 位作者 陈艳 辛晓光 李一经 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期714-718,共5页
对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重... 对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重PCR特异性引物,建立了猪流感H1N1、H1N2和H3N2亚型病毒多重RT-PCR诊断方法。采用该方法对H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒标准参考株进行RT-PCR检测,结果均呈阳性,对扩增得到的片段进行序列测定和BLAST比较,表明为目的基因片段。其它几种常见猪病病毒和其它亚型猪流感病毒的RT-PCR扩增结果都呈阴性。对107EID50/0.1mL病毒进行稀释,提取RNA进行敏感性试验,RT-PCR最少可检测到102EID50的病毒量核酸。对40份阳性临床样品的检测结果是H1N1、H1N2和H3N2亚型分别为16份、1份和20份,其它3份样品同时含有H1N1和H3N2亚型猪流感病毒,和鸡胚分离病毒结果100%一致。试验证明建立的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法是一种特异敏感的诊断方法,可用于临床样品的早期快速诊断和分型。 展开更多
关键词 猪流感 病毒 HIN1 HIN2 H3N2 多重RT-PCR
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猪流感抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量:20
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作者 陈艳 辛晓光 +4 位作者 杨焕良 李婷 李海燕 乔传玲 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期308-311,共4页
猪流感病毒A/Swine/Fujian/668/2001(H3N2)株感染的鸡胚尿囊液,经差速离心后,再经蔗糖密度梯度离心,提纯、纯化的猪流感病毒经NP-40处理并反复冻融,作为猪流感间接ELISA抗原,确立了间接ELISA检测方法。对29份HI试验猪流感为阴性的血清... 猪流感病毒A/Swine/Fujian/668/2001(H3N2)株感染的鸡胚尿囊液,经差速离心后,再经蔗糖密度梯度离心,提纯、纯化的猪流感病毒经NP-40处理并反复冻融,作为猪流感间接ELISA抗原,确立了间接ELISA检测方法。对29份HI试验猪流感为阴性的血清进行了检测,经统计学分析,确定间接ELISA判定标准,被检血清OD_(490nm)值≥0.20判定为阳性。该方法对猪瘟等11种猪疫病阳性血清无交叉反应,批内和批间重复试验的吸收变异系数分别在3.34%~8.12%和6.2%~9.04%之间。与HI的符合率达到92.8%,经卡方检验(P<0.01)比HI试验敏感。为猪流感抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。 展开更多
关键词 猪流感 猪流感病毒 间接ELISA
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禽流感、新城疫可目视化诊断蛋白芯片的制备及初步应用 被引量:14
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作者 石霖 王秀荣 +6 位作者 杨忠苹 陶启蒙 王煜 武嘉男 蔡冬冬 包红梅 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期60-64,共5页
本研究制备了可以同时鉴别诊断禽流感(AI)、新城疫(ND)2种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。以超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了2种病毒蛋白抗原,用点样缓冲液稀释后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;将芯片与待检血清杂交后,再与... 本研究制备了可以同时鉴别诊断禽流感(AI)、新城疫(ND)2种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。以超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了2种病毒蛋白抗原,用点样缓冲液稀释后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;将芯片与待检血清杂交后,再与胶体金标记的二抗杂交,银染显色后根据灰度值判定结果,从而建立了2种禽病的可视化蛋白芯片鉴别诊断方法。采用该方法对18份现地血清样品进行初步检测,结果显示该芯片可特异性的与相应的抗体杂交,无交叉反应,而且呈现较强的杂交信号,其信号灰度值在阳性血清浓度为50μg/mL~300μg/mL范围内成线性关系(Y=0.426X+4.225)。用该芯片方法和琼扩(AGP)抗体检测方法对18份现地样品进行符合率检测,结果表明该可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且检测灵敏度为是AGP方法的400倍以上。研究表明该方法可用于同步鉴别2种禽病,是一种有效的抗体检测新方法。 展开更多
关键词 禽流感 新城疫 可视化 诊断 蛋白芯片
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