B亚型禽偏肺病毒病灭活疫苗对商品蛋鸡的免疫效果研究 被引量：7

1

作者 包媛玲 宋守生 +12 位作者 于蒙蒙 刘鹏 任殿新 孟令宅 王素艳 李欣翼 张卓 刘爱晶 张艳萍 刘长军 祁小乐 王笑梅 高玉龙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期521-525,共5页

为研究B亚型禽偏肺病毒病灭活疫苗对商品蛋鸡的免疫保护效果,本研究选取21日龄的商品蛋鸡,将本团队前期研制的B亚型禽偏肺病毒病灭活疫苗通过肌肉注射方式免疫蛋鸡(0.5 mL/只),并于首免后3周以相同剂量加强免疫1次。免疫后1周~6周每周采... 为研究B亚型禽偏肺病毒病灭活疫苗对商品蛋鸡的免疫保护效果,本研究选取21日龄的商品蛋鸡,将本团队前期研制的B亚型禽偏肺病毒病灭活疫苗通过肌肉注射方式免疫蛋鸡(0.5 mL/只),并于首免后3周以相同剂量加强免疫1次。免疫后1周~6周每周采血,分离血清,采用ELISA检测及中和试验分别检测相应抗体,结果显示,初次免疫后6周,免疫组血清平均ELISA抗体效价达到1:73 522,平均中和抗体效价达到7.6log2。加强免疫后3周通过滴鼻的方式攻毒(aMPV/B LN16强毒滴鼻200μL,5 000 TCID50/只),观察攻毒后1 d~8 d蛋鸡的临床症状。结果显示,攻毒对照组蛋鸡发病率为92.3%,免疫组蛋鸡不发病;攻毒后1 d~8 d采集各组蛋鸡的鼻腔拭子,通过RT-qPCR方法检测病毒拷贝数,结果显示,免疫组蛋鸡鼻腔拭子中的病毒拷贝数较攻毒对照组下降约73.7%~95.0%;攻毒后9 d,采集各组蛋鸡的鼻甲、气管、肺脏制备病理切片后进行病理组织学观察,结果显示,攻毒对照组蛋鸡鼻甲、气管、肺脏出现不同程度的病理损伤,免疫组蛋鸡各组织器官未见明显病理变化。本研究结果首次表明,B亚型禽偏肺病毒病灭活疫苗对商品蛋鸡具有良好的免疫保护效果。本研究为商品蛋鸡的B亚型禽偏肺病毒病的防控和免疫程序的制定提供了参考。 展开更多

关键词 B亚型禽偏肺病毒 灭活疫苗 商品蛋鸡 免疫保护

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鸡传染性法氏囊病病毒VP5缺失标记疫苗的生物学特性研究 被引量：2

2

作者 高立 李凯 +5 位作者 祁小乐 高玉龙 高宏雷 王永强 孔宪刚 王笑梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期659-662,共4页

为评价鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP5缺失病毒株rHLJ0504HT△VP5的生物学特性,本研究首先对该缺失病毒与其亲本病毒rHLJ0504HT(vvIBDV HLJ0504 253/284双位点突变细胞适应病毒)进行了体外复制动力学比较研究。结果表明,VP5缺失病毒复... 为评价鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP5缺失病毒株rHLJ0504HT△VP5的生物学特性,本研究首先对该缺失病毒与其亲本病毒rHLJ0504HT(vvIBDV HLJ0504 253/284双位点突变细胞适应病毒)进行了体外复制动力学比较研究。结果表明,VP5缺失病毒复制滴度明显低于亲本病毒(p<0.05)。动物实验结果表明,该缺失病毒可以诱导机体产生良好的免疫应答反应,免疫后10 d,其抗体水平与亲本病毒相当;并能够抵抗同源或异源超强毒的攻击,为免疫鸡提供100%保护。此外,该缺失病毒对免疫鸡无明显的致病性;VP5缺失病毒免疫组与未免疫组禽流感血凝抑制效价相当,不存在明显差异(p>0.05),表明该病毒对免疫鸡无免疫抑制作用,不影响其它疫苗的免疫效果。而且,VP5的缺失可以作为鉴定该缺失病毒的生物学标记。以上结果表明,rHLJ0504HT△VP5是一株安全有效的IBDV标记候选疫苗株。 展开更多

关键词 鸡传染性法氏囊病病毒 VP5缺失 标记疫苗

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表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90蛋白的重组马立克氏病病毒的构建及生物学特性分析 被引量：7

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作者 许曾焜 李凯 +7 位作者 刘永振 高立 刘长军 张艳萍 高玉龙 祁小乐 崔红玉 王笑梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期867-871,共5页

禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类一种重要免疫抑制性疾病,目前尚无有效的商品化疫苗预防该病。为研制表达RE病毒(REV)gp90蛋白的重组鸡马立克氏病病毒(MDV),本研究构建了含有REV保护性抗原基因gp90的pCAGGS-gp90表达质粒,将gp90表达框... 禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类一种重要免疫抑制性疾病,目前尚无有效的商品化疫苗预防该病。为研制表达RE病毒(REV)gp90蛋白的重组鸡马立克氏病病毒(MDV),本研究构建了含有REV保护性抗原基因gp90的pCAGGS-gp90表达质粒,将gp90表达框架克隆入pENTR1载体,获得重组质粒pENTR1-gp90。通过pENTR1-gp90与p814-5US2KanccdB重组粘粒的LR反应,将gp90表达框架插入p814-5粘粒中MDV 814疫苗株基因组US2基因内,构建重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF),获得重组MDV r814-gp90株。将该重组病毒在CEF中连续传至20代后对第5、10、15、20代病毒经PCR扩增并测序鉴定;利用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测重组MDV感染细胞中gp90蛋白的表达;绘制重组MDV的生长曲线,分析其体外复制特性。结果显示,正确构建了含有gp90表达框架的重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染CEF后能够引起典型的蚀斑病变,且蚀斑形态大小与亲本病毒814株无明显差异。PCR及测序鉴定结果显示,重组病毒r814-gp90基因组中正确插入gp90基因表达框架,且其能够在该重组病毒中稳定存在。IFA及western blot检测结果表明,r814-gp90株能够在感染的CEF中表达gp90蛋白。体外生长曲线显示,r814-gp90株在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异。以上结果表明,本研究正确构建了表达REV保护性抗原gp90基因的重组MDV,为研制RE重组MDV活载体疫苗奠定了基础,对RE以及REV与MDV混合感染的防控具有重要意义。 展开更多

关键词 禽网状内皮组织增生病 gp90蛋白 马立克氏病病毒 重组病毒

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肉鸡禽呼肠孤病毒变异株的分离与致病性研究 被引量：7

4

作者 罗丹 刘芮 +8 位作者 高玉龙 李凯 刘长军 祁小乐 张艳萍 崔红玉 潘青 高立 王笑梅 《中国家禽》 北大核心 2021年第10期25-31,共7页

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况,了解其生物学特性及致病特点,对吉林省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR检测、序列分析及动物回归试验对该分离病毒进行鉴定。结果显示:成功分离到1株肉... 为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况,了解其生物学特性及致病特点,对吉林省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR检测、序列分析及动物回归试验对该分离病毒进行鉴定。结果显示:成功分离到1株肉鸡ARV变异株,将其命名为ARV-JL21-0102;σC基因遗传演化分析显示:该分离病毒与ARV基因Ⅱ型参考株ISR528处于同一进化分支,氨基酸序列相似性为89.8%,而与ARV基因Ⅰ型疫苗株S1133和HeB02株氨基酸序列相似性分别为56.3%和58.4%;该变异株在LMH细胞上增殖良好,对鸡胚和1日龄SPF雏鸡存在一定的致病性;与基因Ⅰ型HeB02株相比,变异株对鸡胚和SPF雏鸡致病性较弱,感染雏鸡发病时间推迟,雏鸡致死率较低。研究结果为全面了解ARV变异株的遗传进化特征和新型疫苗的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 禽呼肠孤病毒 变异株 遗传进化 致病性

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J亚群禽白血病病毒gp85蛋白的真核表达纯化及其生物学活性分析 被引量：1

5

作者 张瑶 任超琪 +7 位作者 于蒙蒙 高祥 管晓璐 祁小乐 王永强 刘长军 王笑梅 高玉龙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期815-819,共5页

gp85蛋白是禽白血病病毒(ALV)的囊膜表面蛋白,含有病毒-受体决定簇,通过识别和结合受体介导病毒侵入宿主细胞。为表达具有正确构象和生物学活性的J亚群ALV(ALV-J)gp85蛋白并对其生物活性进行分析,本研究以pCAGGS为载体,构建N端带有信号... gp85蛋白是禽白血病病毒(ALV)的囊膜表面蛋白,含有病毒-受体决定簇,通过识别和结合受体介导病毒侵入宿主细胞。为表达具有正确构象和生物学活性的J亚群ALV(ALV-J)gp85蛋白并对其生物活性进行分析,本研究以pCAGGS为载体,构建N端带有信号肽编码序列、C端融合Fc编码序列的gp85重组表达质粒pCAGGS-s-gp85-Fc,将其转染293T细胞进行瞬时表达,收集细胞培养液。SDS-PAGE结果表明,gp85-Fc蛋白高效表达,并且经Protein A亲和层析纯化得到高纯度的gp85-Fc蛋白。利用HRV 3C蛋白酶切除Fc标签并且进行分子筛纯化,得到纯度高于90%的gp85蛋白单体。经过流式细胞仪检测,表达的可溶性gp85蛋白能够与ALV-J受体特异性结合。病毒感染阻断试验结果显示,gp85蛋白能够通过封闭受体阻断ALV-J进入DF-1细胞,并且呈现剂量依赖性,在100μg/mL时仍能阻断70%以上的病毒侵入。本研究可溶性的、具有生物学活性的gp85蛋白的制备为体外研究病毒感染宿主细胞机制奠定了的基础。 展开更多

关键词 J亚群禽白血病病毒 gp85 表达 纯化 生物学活性

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北里乳杆菌97-1产细菌素97-1的抑菌活性及生物特性的研究 被引量：5

6

作者 张旺 刘琳琳 +12 位作者 王云峰 王宏磊 祁小乐 高玉龙 王永强 高宏雷 李凯 刘长军 张艳萍 卢彤岩 何高明 王笑梅 崔红玉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期934-937,共4页

为鉴定北里乳杆菌97-1(L.kitasatonis 97-1)所产细菌素的抑菌活性及生物特性,本研究利用菌体吸附法在北里乳杆菌97-1厌氧静置培养后的上清中初步提取细菌素97-1,其抗菌活性在培养稳定期后达到最高值6 400(AU/m L),经试验显示该细菌素能... 为鉴定北里乳杆菌97-1(L.kitasatonis 97-1)所产细菌素的抑菌活性及生物特性,本研究利用菌体吸附法在北里乳杆菌97-1厌氧静置培养后的上清中初步提取细菌素97-1,其抗菌活性在培养稳定期后达到最高值6 400(AU/m L),经试验显示该细菌素能够被大多数蛋白酶降解,但耐受过氧化氢酶的处理;进一步研究表明其细菌素对单核细胞增生李斯特菌的生长具有明显抑制作用,同时可以抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,具有广谱抗菌活性;温度和酸碱耐受试验表明该细菌素对高温、强酸和强碱具有高度耐受性。本研究对细菌素97-1的抑菌活性及生物特性的鉴定,为微生态制剂的研制和开发提供了良好的候选资源。 展开更多

关键词 细菌素 抑菌活性 北里乳杆菌

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一株虹鳟嗜冷益生菌Aeromonas popoffii的分离鉴定及体外抗病毒特性研究 被引量：4

7

作者 王宏磊 崔红玉 +4 位作者 卢彤岩 徐黎明 刘淼 王云峰 王笑梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期40-44,共5页

为分离鉴定冷水鱼类的益生菌,本研究从健康的冷水鱼虹鳟幼鱼的肠道、胆囊等部位分离得到75株嗜冷耐低温生长菌株,经过耐低温温度梯度筛选及体外抗菌试验初步筛选出一株虹鳟嗜冷益生菌株,经革兰氏染色及API 50 CH生化鉴定、16S r DNA测... 为分离鉴定冷水鱼类的益生菌,本研究从健康的冷水鱼虹鳟幼鱼的肠道、胆囊等部位分离得到75株嗜冷耐低温生长菌株,经过耐低温温度梯度筛选及体外抗菌试验初步筛选出一株虹鳟嗜冷益生菌株,经革兰氏染色及API 50 CH生化鉴定、16S r DNA测序比对,鉴定为Aeromonas popoffii,将其命名为HL60分离株。通过耐胆酸游离酸试验、耐酸试验、体外抑菌试验和体外对鲤鱼上皮细胞(EPC)增殖影响试验及体外抗病毒(传染性造血器官坏死病病毒)试验,结果表明A.popoffii HL60分离株具有良好的益生特性及体外抗病毒活性。本研究分离获得的A.popoffii HL60分离株为冷水鱼益生菌株活载体疫苗开发及应用奠定了基础。 展开更多

关键词 益生菌 嗜冷菌 抗病毒特性 益生特性

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进口白羽肉种鸡禽白血病疫情鉴定 被引量：7

8

作者 马美哥 于蒙蒙 +13 位作者 许传田 黄庆华 孟照洁 王素艳 邢立晓 常芳芳 李猷 何希君 刘长军 祁小乐 王永强 孙延鸣 王笑梅 高玉龙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期526-529,共4页

2018年以来,某进口品种肉种鸡发生疑似禽白血病病例,流行范围广,危害严重,为确定该次疫情的病原,本研究从辽宁、山东等地发病鸡场采集55份疑似禽白血病病料样品。病理组织切片观察显示,病料样品肝脏和脾脏均有髓细胞样肿瘤细胞增生。针... 2018年以来,某进口品种肉种鸡发生疑似禽白血病病例,流行范围广,危害严重,为确定该次疫情的病原,本研究从辽宁、山东等地发病鸡场采集55份疑似禽白血病病料样品。病理组织切片观察显示,病料样品肝脏和脾脏均有髓细胞样肿瘤细胞增生。针对禽白血病病毒(ALV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮组织增生症病毒(REV)的特异性PCR检测结果显示,55份病料样品中ALV阳性样品12份(21.8%),MDV阳性样品1份(1.82%),REV均为阴性。将12份ALV阳性病料样品经处理后接种DF-1细胞进行病毒分离,ELISA检测结果显示有8份ALV群特异性抗原阳性。ALV多重PCR检测结果表明,8个分离株均为J亚群ALV(ALV-J),测序结果显示,8个分离株之间核苷酸序列同源性为99.5%~100%,与A、B、C、D、E亚群ALV的同源性仅为56.5%~58.8%,与ALV-J的同源性为90.7%~96.6%,进一步表明所有分离株均为ALV-J。上述结果表明,引起该次进口白羽父母代肉种鸡发生禽白血病的病原主要以ALV-J为主,该研究结果为疫情的溯源和有效防控奠定了基础。 展开更多

关键词 进口白羽肉种鸡 禽白血病 J亚群禽白血病病毒 病毒分离

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进口白羽肉种鸡J亚群禽白血病病毒的全基因组序列分析 被引量：6

9

作者 马美哥 于蒙蒙 +11 位作者 许传田 黄庆华 孟照洁 王素艳 邢立晓 常方方 刘长军 祁小乐 王永强 孙延鸣 王笑梅 高玉龙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期750-754,共5页

为研究引起我国部分地区进口白羽肉种鸡发生禽白血病疫情的病毒来源及其变异趋势,本研究对从进口白羽肉种鸡分离的8株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的全基因组序列进行测序分析。8株ALV-Jgp85氨基酸遗传演化分析显示,其与ALV-J肉鸡分离株(包... 为研究引起我国部分地区进口白羽肉种鸡发生禽白血病疫情的病毒来源及其变异趋势,本研究对从进口白羽肉种鸡分离的8株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的全基因组序列进行测序分析。8株ALV-Jgp85氨基酸遗传演化分析显示,其与ALV-J肉鸡分离株(包括ALV-J原型病毒株HPRS-103、美国肉鸡ALV-J分离株、国内肉鸡分离株)及蛋鸡分离株氨基酸序列同源性均低于92.5%,而与国内2014年父母代白羽肉种鸡ALV-J分离株GD14J2同源性较高,为93.5%~95.1%,处于同一分支。8株ALV-J的3'非编码区(3'UTR)在rTM区缺失203bp,DR-1区缺失7bp,E元件位置缺失125bp,仅保留了22个碱基,这一缺失特征与GD14J2一致。8株ALV-J的3'LTRU3区序列与ALV-J肉鸡分离株及蛋鸡分离株的相应基因序列同源性均低于91.5%,而与GD14J2病毒株的同源性较高,为94.3%~96.3%。序列分析发现U3区存在连续11bp缺失和164位碱基突变(C/T),该突变形成2个新的转录调控元件AIBREP1、AIBREP2。综合gp85、3'UTR和U3区序列特征,推测引起本次进口白羽肉种鸡禽白血病的ALV-J与国内2014年父母代白羽肉种鸡ALV-J分离株GD14J2为同一来源。但本次分离到的ALV-J病毒株也有新的变异趋势,这些变异是否与ALV-J致病性相关,还需进一步研究。本研究为ALV-J有效防控和净化提供数据支持。 展开更多

关键词 进口肉种鸡 禽白血病 J亚群禽白血病病毒 全基因组序列分析

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鸡马立克氏病病毒感染对鸡神经系统损伤的研究 被引量：5

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作者 周林宜 张艳萍 +7 位作者 孙国荣 张峰 于正浩 高玉龙 祁小乐 李凯 王笑梅 刘长军 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期113-117,共5页

为研究不同毒力的鸡马立克氏病毒(MDV)在鸡神经系统中的感染规律及其对神经系统的损伤进程,本研究选用不同毒力的血清1型MDV (MDV-1)病毒株感染4日龄的SPF鸡,在接毒后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d、25 d、28 d和35 d动... 为研究不同毒力的鸡马立克氏病毒(MDV)在鸡神经系统中的感染规律及其对神经系统的损伤进程,本研究选用不同毒力的血清1型MDV (MDV-1)病毒株感染4日龄的SPF鸡,在接毒后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d、25 d、28 d和35 d动态检测病毒载量的变化,并对感染后5 d和21 d的不同病毒株感染鸡的脑部和坐骨神经进行组织病理学观察。结果显示,MDV-1强毒株在SPF鸡脑部的复制能力显著高于弱毒株(p<0.05);特超强病毒株BS在脑组织中出现的时间最早,早期复制最快。但不同毒力的MDV-1株在坐骨神经处的复制能力与其毒力无直接的关系。组织病理学观察显示,在感染早期MDV-1强毒株对SPF鸡脑组织的损伤强于弱毒株;在感染后21 d,强毒株和弱毒株造成的脑部损伤存在明显的不同;而在坐骨神经处,强毒株造成的损伤明显强于弱毒株。本研究揭示了不同MDV病毒株在SPF鸡脑和坐骨神经的复制动力学特征和组织病理学特征,为MDV-1在宿主神经系统中的感染、增殖及造成的损伤提供了实验依据。 展开更多

关键词 鸡马立克氏病 神经系统 病毒载量 病理损伤

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K亚群禽白血病病毒细胞受体的鉴定 被引量：5

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作者 邢立晓 俞燕 +7 位作者 于蒙蒙 常方方 包媛玲 王素艳 高立 祁小乐 王笑梅 高玉龙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期802-808,共7页

禽白血病病毒(ALV)进入细胞启动感染依赖于其囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合。K亚群ALV(ALV-K)是2012年从我国本地芦花鸡中分离到的一个ALV新亚群。为了鉴定ALV-K的细胞受体,本研究利用真核细胞表达了A和K亚群ALV gp85蛋白,并利用实... 禽白血病病毒(ALV)进入细胞启动感染依赖于其囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合。K亚群ALV(ALV-K)是2012年从我国本地芦花鸡中分离到的一个ALV新亚群。为了鉴定ALV-K的细胞受体,本研究利用真核细胞表达了A和K亚群ALV gp85蛋白,并利用实验室前期拯救的重组病毒RCAS-A-GFP和RCAS-K-GFP进行病毒受体的交叉干扰试验,结果显示A亚群ALV(ALV-A)gp85蛋白能够抑制ALV-K的感染,同样ALV-Kgp85蛋白也能够抑制ALV-A的感染,存在受体交叉干扰现象,因而推测二者可能共用细胞受体。已有研究表明Tva是ALV-A的细胞受体,本研究利用Co-IP和Pull-down试验检测了ALV-Kgp85与Tva的互作,结果显示ALV-Kgp85蛋白能与可溶性的Tva(sTva)相互作用。进一步的流式细胞术结果显示ALV-Kgp85能够高效结合Tva,结合率在90%以上。为进一步验证Tva是否能介导ALV-K进入细胞,利用ALV的非易感细胞HEK293T进行了Tva受体重建试验,结果显示RCAS-K-GFP能够进入表达Tva的293T细胞并复制产生较强的绿色荧光。以上结果充分表明Tva也是ALV-K的细胞受体,能够介导ALV-K进入宿主细胞,启动其感染。该研究为阐明ALV-K侵入宿主细胞机制及抗病毒靶点筛选奠定了基础。 展开更多

关键词 K亚群禽白血病病毒 细胞受体 Tva蛋白 结合 进入

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抗禽白血病病毒p27蛋白线性抗原表位的鉴定 被引量：3

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作者 李晓菲 朱海波 +7 位作者 高奇 王琦 孙佳善 高玉龙 祁小乐 王永强 高宏雷 王笑梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期632-635,共4页

为鉴定禽白血病病毒(ALV)p27蛋白中的线性抗原表位,本研究以原核表达的重组p27蛋白免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA方法筛选纯化获得一株能够稳定分泌特异性单克隆抗体(MAb)的杂交... 为鉴定禽白血病病毒(ALV)p27蛋白中的线性抗原表位,本研究以原核表达的重组p27蛋白免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA方法筛选纯化获得一株能够稳定分泌特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。Western blot试验结果显示,该MAb可以识别ALV的群特异性抗原p27蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,MAb与A、B和J亚群ALV均呈阳性反应。对p27蛋白进行截短表达,利用western blot和间接ELISA进行表位鉴定,确定了MAb所识别的抗原表位位于129LVAITASALQAFRE142。氨基酸序列比对结果显示,本研究所鉴定出的p27表位在A、B和J亚群ALV之间高度保守。本研究为ALV检测方法的建立及其免疫学功能的研究提供了有利的工具。 展开更多

关键词 禽白血病病毒 P27蛋白 单克隆抗体 抗原表位

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荧光定量PCR方法在鸡马立克氏病疫苗免疫监测中的应用分析 被引量：2

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作者 兰兴鸽 张艳萍 +9 位作者 于正浩 王亚楠 高玉龙 祁小乐 崔红玉 高立 李凯 潘青 王笑梅 刘长军 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期727-733,共7页

鸡马立克氏病(MD)的防控主要依靠疫苗免疫,MD疫苗株在鸡体内的有效复制与最终的免疫效果直接相关,可通过这种相关性对MD疫苗进行免疫监测。为有效监测MD疫苗的免疫效果,本研究共采用两种血清1型MD疫苗免疫不同的鸡:(1)实验鸡分为两组:... 鸡马立克氏病(MD)的防控主要依靠疫苗免疫,MD疫苗株在鸡体内的有效复制与最终的免疫效果直接相关,可通过这种相关性对MD疫苗进行免疫监测。为有效监测MD疫苗的免疫效果,本研究共采用两种血清1型MD疫苗免疫不同的鸡:(1)实验鸡分为两组:一组在1日龄时免疫血清1型MD疫苗814株,另一组为不免疫的对照组,选用双重荧光定量PCR方法分别对两组鸡免疫后7 d和14 d的脾脏和羽髓中的马立克氏病病毒(MDV)载量(log10 MDV拷贝数/106个细胞)进行检测;(2)商品鸡:选用上述双重荧光定量PCR方法分别对经血清1型MD疫苗CVI988/Rispens株免疫后7 d和14 d的商品蛋鸡脾脏和羽髓中的MDV载量进行检测。并针对荧光定量PCR的检测结果结合常规PCR检测和meq基因的序列比对分析各组鸡脾脏和羽髓样品是否被野毒感染;同时监测正常免疫商品鸡的产蛋率和死淘率等至8个月鸡龄。结果显示,实验鸡免疫后7 d,免疫组鸡脾脏和羽髓的MDV载量为3.39~4.69,对照组鸡相应样品的MDV载量为3.36~4.90;免疫后14 d,免疫组鸡MDV载量为3.77~4.86,对照组鸡相应样品的MDV载量为5.06~6.22,对照组显著高于免疫组(p<0.01)。PCR鉴定和meq基因序列分析证实,对照组鸡被MDV野毒感染,导致其体内MDV载量的显著上升。商品鸡免疫后7 d,脾脏和羽髓的MDV载量为3.75~4.59;免疫后14 d,MDV载量为3.71~4.92,并且在监测期内没有发生MD。以上结果表明,利用双重荧光定量PCR方法对血清1型MD疫苗进行免疫监测时,免疫后7 d~14 d鸡体内的病毒载量为3.39~4.86,载量过高则可能发生了免疫失败或者野毒感染。本研究结果表明双重荧光定量PCR方法可以用于MD疫苗免疫效果的监测,为临床鸡MD疫苗的免疫监测提供了参考数据。。 展开更多

关键词 马立克氏病 病毒载量 双重荧光定量PCR 免疫监测

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RCAS(J)-Luciferase重组病毒拯救及其相关生物学功能鉴定 被引量：1

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作者 管晓璐 张瑶 +9 位作者 刘永振 祁小乐 王永强 刘长军 崔红玉 张艳萍 李凯 高立 王笑梅 高玉龙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期177-181,共5页

RCAS载体系列是基于A型罗斯肉瘤病毒(RSV-A)所改造而成的反转录病毒感染性克隆,转染易感细胞后,能够产生高滴度的RSV-A病毒。同时,RCAS载体可携带外源基因进入靶细胞,从而进行蛋白的高效表达。为了获取滴度高且易于检测的RSV,进行ALV-J... RCAS载体系列是基于A型罗斯肉瘤病毒(RSV-A)所改造而成的反转录病毒感染性克隆,转染易感细胞后,能够产生高滴度的RSV-A病毒。同时,RCAS载体可携带外源基因进入靶细胞,从而进行蛋白的高效表达。为了获取滴度高且易于检测的RSV,进行ALV-J受体方面的研究,本研究将RCAS(A)-GFP载体中RSV-A的囊膜蛋白基因替换为ALV-J的囊膜蛋白基因,并将绿色荧光蛋白报告基因(gfp)替换为海参荧光素酶(luciferase)报告基因,构建带有luciferase报告基因的囊膜蛋白为ALV-J囊膜蛋白的RSV重组病毒。经验证,本研究所构建的重组病毒,与传统的ALV-J株相比,具有复制能力强,病毒滴度高等优点,而且能够通过ALV-J特异性受体ch NHE1感染ALV-J非允许细胞系,有利于病毒感染初期的检测和定量,为病毒与其受体之间相互作用的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 RCAS LUCIFERASE 重组病毒 受体

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表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其表达的优化 被引量：8

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作者 张旺 刘琳琳 +9 位作者 祁小乐 高玉龙 王永强 高宏雷 李凯 高立 刘长军 张艳萍 王笑梅 崔红玉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期825-828,共4页

鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2蛋白是该病毒的主要抗原蛋白,为制备乳酸菌黏膜免疫口服疫苗,本研究采用乳酸乳球菌(L.lactis)及其Nisin诱导的表达系统,对VP2基因进行密码子优化,构建了表达IBDVVP2蛋白的重组乳酸乳球菌L.lactis/p NZ-VP... 鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2蛋白是该病毒的主要抗原蛋白,为制备乳酸菌黏膜免疫口服疫苗,本研究采用乳酸乳球菌(L.lactis)及其Nisin诱导的表达系统,对VP2基因进行密码子优化,构建了表达IBDVVP2蛋白的重组乳酸乳球菌L.lactis/p NZ-VP2。经正交试验对诱导条件进行优化,重组VP2蛋白(r VP2)表达量比优化前明显提高,最终得到最佳诱导条件为:OD600nm=0.5开始诱导,Nisin终浓度为2 ng/m L,诱导时间为5 h,r VP2表达量达到最大值38μg/m L。经western blot检测,r VP2能够持续性表达并具有良好的抗原性。该重组乳酸菌的构建为进一步体内免疫实验奠定了基础。 展开更多

关键词 鸡传染性法氏囊病毒 重组乳酸菌 VP2蛋白

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鸡传染性法氏囊病病毒B节段对病毒致病性的影响 被引量：3

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作者 高立 李凯 +5 位作者 祁小乐 高玉龙 高宏雷 王永强 孔宪刚 王笑梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期510-514,共5页

为研究鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)3个不同亚群B节段对病毒致病性的影响,本实验将IBDV HLJ0504超强毒株的A节段分别与3个亚群(Ⅰ亚群Gt株、Ⅱ亚群HLJ0504株及Ⅲ亚群HuB-1株)B节段进行组合,拯救了rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB3种重组病毒... 为研究鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)3个不同亚群B节段对病毒致病性的影响,本实验将IBDV HLJ0504超强毒株的A节段分别与3个亚群(Ⅰ亚群Gt株、Ⅱ亚群HLJ0504株及Ⅲ亚群HuB-1株)B节段进行组合,拯救了rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB3种重组病毒。动物实验结果表明,rH4AHuB引起雏鸡死亡率为80%、rH4AH4B次之为73.3%、rH4AGtB仅为33.3%。此外,rH4AHuB在体内复制的能力明显高于rH4AGtB(p<0.05),但与rH4AH4B无明显差异(p>0.05)。以上结果表明,IBDV B节段影响病毒的致病性,不同亚群B节段对IBDV致病性的影响作用不同。其中,第II、III亚群的B节段能够提高病毒在体内的复制能力,从而使IBDV的致病性增强,而第I亚群的B节段则降低了病毒在体内的复制能力,使IBDV的致病性减弱。 展开更多

关键词 鸡传染性法氏囊病病毒 B节段 复制 致病性

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新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及其σC基因遗传进化分析 被引量：15

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作者 罗丹 高立 +6 位作者 孟照洁 高玉龙 李凯 祁小乐 刘长军 崔红玉 王笑梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期445-450,共6页

新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)病,是一种以肝脾不规则坏死、出血斑/点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病。为研究某养鸭企业不同年份分离的NDRV病株的生物学特性,本研究将2019年从25份樱桃谷鸭脏器组织中分离的3株病毒以及2016年和2017年... 新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)病,是一种以肝脾不规则坏死、出血斑/点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病。为研究某养鸭企业不同年份分离的NDRV病株的生物学特性,本研究将2019年从25份樱桃谷鸭脏器组织中分离的3株病毒以及2016年和2017年分离的2株病毒同时进行了生物学特性比较研究。RT-PCR及基因测序结果表明,该5株分离病毒均为NDRV,且纯净性良好。体外复制研究表明,该5株分离病毒均能100%致死鸡胚,且在Vero细胞中增殖良好;除2017年的分离株外,其余4株分离病毒均能在CEF中产生明显的细胞病变。σC基因同源性及遗传进化分析显示,5株NDRV分离株与其它NDRV病毒株之间具有较高的同源性(90.0%~98.2%),而与番鸭呼肠孤病毒(MDRV)同源性较低(29.6%~46.1%),再次证明5株分离病毒均为NDRV,但2017年分离株NDRV-SD19/6202与其余4株病毒的遗传距离稍远。σC基因编码氨基酸序列分析结果显示,以CEF适应病毒为代表的NDRV-SD19/6201株与CEF非适应病毒NDRV-SD19/6202株之间存在13个氨基酸差异位点,但这些差异位点是否是引起两株病毒复制特性差异的关键氨基酸还需要进一步研究。综上,本研究结果表明来源于同一养殖企业不同年份分离的NDRV病毒株之间生物学特性存在一定差异,提示持续开展该病流行病学调查的必要性,同时为了解NDRV的遗传进化特征和基因变异情况提供参考。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 分离鉴定 σC基因 遗传进化

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新型鸭呼肠孤病毒群特异性抗原蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备 被引量：4

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作者 罗丹 杨伏春 +8 位作者 高立 李凯 祁小乐 高玉龙 刘长军 张艳萍 崔红玉 潘青 王笑梅 《中国家禽》 北大核心 2020年第11期27-32,共6页

为制备新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)群特异性抗原σB的多克隆抗体,研究采用RT-PCR方法扩增NDRV-SD19/6201株σB基因编码序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western... 为制备新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)群特异性抗原σB的多克隆抗体,研究采用RT-PCR方法扩增NDRV-SD19/6201株σB基因编码序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示,NDRV群特异性抗原σB获得高效表达,重组蛋白分子量约55 ku,该重组蛋白具有良好的免疫活性,能与His-标签抗体及NDRV阳性血清发生特异性结合反应。以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,获得高效价多克隆抗体,效价1∶12 800以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能特异性识别多株NDRV毒株,具有较好的免疫反应活性。研究为建立NDRV血清学诊断方法提供了材料,同时为探究σB蛋白生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 群特异性抗原蛋白 σB 多克隆抗体

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黏附与聚集、抗肿瘤及抗菌特性乳杆菌的筛选 被引量：7

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作者 宋雨心 王文骞 +13 位作者 张园 刘琳琳 王婷婷 祁小乐 高玉龙 王永强 高宏雷 李凯 刘长军 张艳萍 高立 王笑梅 崔红玉 何高明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期986-991,共6页

为获得具有高黏附与聚集、抗肿瘤及抗菌特性的益生乳杆菌,本研究以10株经16s r DNA鉴定的乳杆菌为候选菌,以结肠癌HT-29细胞为体外模型研究其黏附能力和抗肿瘤特性及其黏附能力与自聚集能力的相关性。将乳杆菌与致病性大肠埃希氏菌、鸡... 为获得具有高黏附与聚集、抗肿瘤及抗菌特性的益生乳杆菌,本研究以10株经16s r DNA鉴定的乳杆菌为候选菌,以结肠癌HT-29细胞为体外模型研究其黏附能力和抗肿瘤特性及其黏附能力与自聚集能力的相关性。将乳杆菌与致病性大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌及金黄色葡萄球菌分别共孵育,探究了乳杆菌的共聚集能力与抗菌能力。结果显示:有6株乳杆菌的自聚集能力在20%以上;4株乳杆菌粘附内化HT-29细胞的内化率超过5%,经荧光显微镜观察,菌株Lac.99对HT-29细胞具有最强的黏附特性;菌株Lac.117和Lac.56对HT-29细胞的生长具有较好的抑制作用;4株乳杆菌对指示致病菌具有较强的拮抗作用,其中Lac.117菌株作用最强。综上所述,候选菌株中Lac.56在黏附、抗菌和抗肿瘤方面均表现出良好的益生特性,本实验为进一步研究和开发具有潜在应用价值的益生菌制剂提供了依据。 展开更多

关键词 乳杆菌 黏附 抗肿瘤 抗菌活性

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