【目的】目前国内外西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的核酸检测中缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,对检测结果的精确度和可信度造成一定的影响。本研究旨在研制一种安全稳定的WNV核酸检测质控品,为西尼罗热监测提供技术支持。【方法】...【目的】目前国内外西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的核酸检测中缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,对检测结果的精确度和可信度造成一定的影响。本研究旨在研制一种安全稳定的WNV核酸检测质控品,为西尼罗热监测提供技术支持。【方法】将WNV核酸检测靶基因、MS2噬菌体外壳蛋白CP及成熟酶蛋白A基因序列插入到表达载体得到重组质粒pET-CPA-WN,经转化、表达、纯化后,制备WNV装甲RNA质控品,并对其进行实时荧光定量PCR和数字PCR定量、均匀性及稳定性分析,评估其作为标准物质的可能性。【结果】PCR检测、双酶切和基因测序结果均显示已成功构建重组质粒pET-CPA-WN,表达纯化后得到了大小均一、直径为23~28 nm的病毒样颗粒。核酸酶消化后实时荧光定量PCR检测结果显示,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的装甲RNA;其定植结果为8.80×10~9拷贝/mL。稳定性试验结果表明,该装甲RNA可在37℃稳定保持20 d,随机抽取10个样本进行均匀性检验证明其均匀性良好。【结论】本研究基于MS2噬菌体制备的装甲RNA拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为WNV分子检测提供安全、稳定的参考样品。展开更多
西尼罗热(West Nile fever,WNF)是由西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)感染引起的一种人兽共患病,主要通过蚊子叮咬传播,临床表现以发热、皮疹和淋巴结肿大等为主,可侵犯中枢神经系统产生脑炎症状,人类对其高度易感且致死率较高。对于WN...西尼罗热(West Nile fever,WNF)是由西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)感染引起的一种人兽共患病,主要通过蚊子叮咬传播,临床表现以发热、皮疹和淋巴结肿大等为主,可侵犯中枢神经系统产生脑炎症状,人类对其高度易感且致死率较高。对于WNF的防控目前尚无可用疫苗和特效治疗药物。及时、准确的诊断,对治疗和防止疫情的快速传播具有极重要的意义。本文对当前WNV检测技术的最新成果、诊断方法发展方向进行了概述,其中病原学诊断技术主要包括病毒分离、RT-PCR、等温扩增技术等,血清学诊断包括ELISA、免疫荧光法和免疫组织化学技术等,近年来基于高通量测序的宏基因组技术也成功应用于WNF的诊断与研究,新技术的创新及其在疫病检测上的应用将极大地促进WNF的检测和防控技术的发展。展开更多
文摘【目的】目前国内外西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的核酸检测中缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,对检测结果的精确度和可信度造成一定的影响。本研究旨在研制一种安全稳定的WNV核酸检测质控品,为西尼罗热监测提供技术支持。【方法】将WNV核酸检测靶基因、MS2噬菌体外壳蛋白CP及成熟酶蛋白A基因序列插入到表达载体得到重组质粒pET-CPA-WN,经转化、表达、纯化后,制备WNV装甲RNA质控品,并对其进行实时荧光定量PCR和数字PCR定量、均匀性及稳定性分析,评估其作为标准物质的可能性。【结果】PCR检测、双酶切和基因测序结果均显示已成功构建重组质粒pET-CPA-WN,表达纯化后得到了大小均一、直径为23~28 nm的病毒样颗粒。核酸酶消化后实时荧光定量PCR检测结果显示,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的装甲RNA;其定植结果为8.80×10~9拷贝/mL。稳定性试验结果表明,该装甲RNA可在37℃稳定保持20 d,随机抽取10个样本进行均匀性检验证明其均匀性良好。【结论】本研究基于MS2噬菌体制备的装甲RNA拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为WNV分子检测提供安全、稳定的参考样品。
文摘西尼罗热(West Nile fever,WNF)是由西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)感染引起的一种人兽共患病,主要通过蚊子叮咬传播,临床表现以发热、皮疹和淋巴结肿大等为主,可侵犯中枢神经系统产生脑炎症状,人类对其高度易感且致死率较高。对于WNF的防控目前尚无可用疫苗和特效治疗药物。及时、准确的诊断,对治疗和防止疫情的快速传播具有极重要的意义。本文对当前WNV检测技术的最新成果、诊断方法发展方向进行了概述,其中病原学诊断技术主要包括病毒分离、RT-PCR、等温扩增技术等,血清学诊断包括ELISA、免疫荧光法和免疫组织化学技术等,近年来基于高通量测序的宏基因组技术也成功应用于WNF的诊断与研究,新技术的创新及其在疫病检测上的应用将极大地促进WNF的检测和防控技术的发展。
