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题名弓形虫TgMIT蛋白的鉴定和功能分析
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作者
邓舒予
尹萌
应铸
刘晶
刘群
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机构
中国农业大学动物医学院国家动物寄生原虫实验室农业农村部动物流行病学重点实验室
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出处
《中国兽医杂志》
北大核心
2025年第10期1-8,共8页
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基金
国家重点研发计划(2022YFD1800205)。
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文摘
线粒体转铁蛋白(MIT)是真核生物中一类关键的铁离子转运蛋白,在维持细胞内铁离子稳态和氧化还原平衡中发挥重要作用。本试验将酵母MIT的氨基酸序列在弓形虫数据库中进行同源序列比对,获得了弓形虫中的同源蛋白TgMIT。为研究TgMIT蛋白在弓形虫中的定位和功能,利用成簇规律间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建TgMIT内源性标记虫株(TgMIT-3HA虫株),通过聚合酶链式反应(PCR)、蛋白免疫印迹(WB)和免疫荧光分析(IFA)进行鉴定,采用IFA探究TgMIT蛋白的定位,WB探究不同铁离子环境对TgMIT蛋白相对表达量的影响;构建基因敲除虫株(Δmit虫株)并通过PCR进行验证,采用噬斑试验、入侵试验和增殖试验分析TgMIT蛋白对弓形虫生命活动的影响,通过检测活性氧(ROS)水平、还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值,探究Δmit虫株的氧化还原状态。结果显示,TgMIT-3HA虫株构建成功;TgMIT蛋白定位于虫体质膜;与未处理组相比,低铁环境中TgMIT蛋白相对表达量显著下调(P<0.01),高铁环境中其相对表达量极显著上调(P<0.001或P<0.0001)。Δmit虫株构建成功,mit基因缺失极显著抑制虫体噬斑形成能力(P<0.0001)、入侵能力(P<0.001)和增殖能力(P<0.0001),并导致虫体氧化应激,表现为ROS水平极显著升高(P<0.01),GSH/GSSG比值显著降低(P<0.05)。综上所述,TgMIT蛋白定位于弓形虫质膜,是一种铁离子调控相关蛋白,对维持氧化还原平衡和虫体正常生命活动至关重要。
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关键词
刚地弓形虫
TgMIT
CRISPR/Cas9
铁离子
氧化还原
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Keywords
Toxoplasma gondii
TgMIT
CRISPR/Cas9
iron ion
oxidation reduction
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分类号
S855.9
[农业科学—临床兽医学]
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