为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a ...为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a AM V反转录酶合成F irst-strand cDNA(fcDNA)。根据G enB ank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含E coRⅠ和H indⅢ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含L acZ基因的原核克隆载体pGEM-T E asy中,转化至大肠杆菌JM 109感受态细胞,经E coRⅠ和H indⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pM AL-p2X,构建重组表达质粒p2Xβ-2m。将重组表达质粒转化入大肠杆菌E.coli TB 1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了W estern b lot鉴定。本研究为进一步利用BF 2的胞外区在体外共同构建MHCⅠ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。展开更多
鸡传染性法氏囊病(in fectious bursa l d isease,IBD)是一种严重危害养禽业健康发展的传染病,该病感染后不但造成重大的损失,还引起不同程度的免疫抑制,给禽群免疫带来更大的困扰。作者对发生在河南某地区的IBD免疫失败进行了研究,研...鸡传染性法氏囊病(in fectious bursa l d isease,IBD)是一种严重危害养禽业健康发展的传染病,该病感染后不但造成重大的损失,还引起不同程度的免疫抑制,给禽群免疫带来更大的困扰。作者对发生在河南某地区的IBD免疫失败进行了研究,研究结果发现:鸡群免疫使用的鸡传染性法氏囊炎中等毒力苗每瓶标识含量均为500羽份,发生严重免疫失败的A疫苗抽检的6瓶测得的0.1 m l疫苗稀释液的TC ID50分别是1-0 2.2、1-0 2.7、100、10-2.9、1-0 1.9、100,即每瓶实际分别含有3.17、10.04、0、15.9、1.3和0羽份。而当地市场使用效果较好的B疫苗和C疫苗每瓶疫苗分别平均含有485和453羽份。疫苗有效含量不足是该地区IBD免疫失败的主要原因。展开更多
文摘为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a AM V反转录酶合成F irst-strand cDNA(fcDNA)。根据G enB ank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含E coRⅠ和H indⅢ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含L acZ基因的原核克隆载体pGEM-T E asy中,转化至大肠杆菌JM 109感受态细胞,经E coRⅠ和H indⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pM AL-p2X,构建重组表达质粒p2Xβ-2m。将重组表达质粒转化入大肠杆菌E.coli TB 1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了W estern b lot鉴定。本研究为进一步利用BF 2的胞外区在体外共同构建MHCⅠ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。
文摘鸡传染性法氏囊病(in fectious bursa l d isease,IBD)是一种严重危害养禽业健康发展的传染病,该病感染后不但造成重大的损失,还引起不同程度的免疫抑制,给禽群免疫带来更大的困扰。作者对发生在河南某地区的IBD免疫失败进行了研究,研究结果发现:鸡群免疫使用的鸡传染性法氏囊炎中等毒力苗每瓶标识含量均为500羽份,发生严重免疫失败的A疫苗抽检的6瓶测得的0.1 m l疫苗稀释液的TC ID50分别是1-0 2.2、1-0 2.7、100、10-2.9、1-0 1.9、100,即每瓶实际分别含有3.17、10.04、0、15.9、1.3和0羽份。而当地市场使用效果较好的B疫苗和C疫苗每瓶疫苗分别平均含有485和453羽份。疫苗有效含量不足是该地区IBD免疫失败的主要原因。
