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中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基克隆、表达及功能初步鉴定
1
作者
陶颖
杨东亮
+4 位作者
王宝菊
刘艺
桂文甲
李智
樊和斌
《临床肝胆病杂志》
CAS
北大核心
2024年第2期278-283,共6页
目的克隆中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基(mhIFNAR2)的基因,并进行抗体制备及功能鉴定。方法应用RT-PCR技术,从中国旱獭脾组织中扩增得到序列,克隆至原核表达载体p RSET-B,表达重组蛋白,电泳和Western Blot法鉴定;重组蛋白常规免疫BALB/c...
目的克隆中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基(mhIFNAR2)的基因,并进行抗体制备及功能鉴定。方法应用RT-PCR技术,从中国旱獭脾组织中扩增得到序列,克隆至原核表达载体p RSET-B,表达重组蛋白,电泳和Western Blot法鉴定;重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠制备其胞外段多克隆抗体,免疫组化、免疫荧光和Western Blot法鉴定;再通过si RNA阻断的方法检测其功能。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果从mhIFNAR2扩增出149~1300 bp片段,其同源性在分析的种属中以土拨鼠最高,可达98.05%。成功地构建了表达胞外段mhIFNAR2_((50-181aa))蛋白的原核表达质粒,命名为pRSET-B.mhIFNAR2;其表达重组蛋白分子量27 kD,纯化后纯度约为95%,浓度约为160μg/mL。用纯化的重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠后,获得1∶1000的特异性多克隆抗体,用免疫组化及免疫荧光可见细胞膜、细胞质有表达。合成的三条siRNA,其中有一条起始于277位点的siRNA(siRNA277)与空白对照及阴性对照相比,可以沉默目的基因的表达,并能减弱干扰素的信号通路(P值均<0.05)。结论获得mhIFNAR2的部分序列,成功地制备出抗mhIFNAR2胞外段多克隆抗体,该抗体有较高的效价和特异性,并能用于免疫组化、免疫荧光及Western Blot的检测。用siRNA277可以抑制目的基因的表达,并能阻断干扰素的信号通路。
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关键词
受体
干扰素αβ
克隆
乙型肝炎
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题名
中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基克隆、表达及功能初步鉴定
1
作者
陶颖
杨东亮
王宝菊
刘艺
桂文甲
李智
樊和斌
机构
中国人民解放军中部战区总医院感染科
华中
科
技大学同济医学院附属协和
医院
感染
科
出处
《临床肝胆病杂志》
CAS
北大核心
2024年第2期278-283,共6页
基金
国家自然科学基金(3021170)
国家重大基础研究项目(973)(2005CB522900)。
文摘
目的克隆中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基(mhIFNAR2)的基因,并进行抗体制备及功能鉴定。方法应用RT-PCR技术,从中国旱獭脾组织中扩增得到序列,克隆至原核表达载体p RSET-B,表达重组蛋白,电泳和Western Blot法鉴定;重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠制备其胞外段多克隆抗体,免疫组化、免疫荧光和Western Blot法鉴定;再通过si RNA阻断的方法检测其功能。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果从mhIFNAR2扩增出149~1300 bp片段,其同源性在分析的种属中以土拨鼠最高,可达98.05%。成功地构建了表达胞外段mhIFNAR2_((50-181aa))蛋白的原核表达质粒,命名为pRSET-B.mhIFNAR2;其表达重组蛋白分子量27 kD,纯化后纯度约为95%,浓度约为160μg/mL。用纯化的重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠后,获得1∶1000的特异性多克隆抗体,用免疫组化及免疫荧光可见细胞膜、细胞质有表达。合成的三条siRNA,其中有一条起始于277位点的siRNA(siRNA277)与空白对照及阴性对照相比,可以沉默目的基因的表达,并能减弱干扰素的信号通路(P值均<0.05)。结论获得mhIFNAR2的部分序列,成功地制备出抗mhIFNAR2胞外段多克隆抗体,该抗体有较高的效价和特异性,并能用于免疫组化、免疫荧光及Western Blot的检测。用siRNA277可以抑制目的基因的表达,并能阻断干扰素的信号通路。
关键词
受体
干扰素αβ
克隆
乙型肝炎
Keywords
Receptor,Interferon alpha-beta
Clone
Hepatitis B
分类号
R392 [医药卫生—免疫学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
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1
中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基克隆、表达及功能初步鉴定
陶颖
杨东亮
王宝菊
刘艺
桂文甲
李智
樊和斌
《临床肝胆病杂志》
CAS
北大核心
2024
0
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