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人类胚胎干细胞向造血干细胞分化的微环境研究
1
作者 王建 林戈 +1 位作者 赵惠萍 卢光绣 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期1119-1122,共4页
目的探讨胎肝基质细胞和骨髓基质细胞在诱导胚胎干细胞向血液血管干细胞分化中的作用,分析基因表达差异。方法通过将分化4d的EBs分别接种到以下两组中:(1)胎肝基质细胞层+细胞因子;(2)骨髓基质细胞层+细胞因子;诱导结束后,流式细胞术检... 目的探讨胎肝基质细胞和骨髓基质细胞在诱导胚胎干细胞向血液血管干细胞分化中的作用,分析基因表达差异。方法通过将分化4d的EBs分别接种到以下两组中:(1)胎肝基质细胞层+细胞因子;(2)骨髓基质细胞层+细胞因子;诱导结束后,流式细胞术检测各组中血液血管干细胞标志KDR阳性细胞数以及造血干细胞标志CD34阳性细胞数,计数细胞分化过程中形成的造血干细胞样的集落数,比较诱导分化效果;收集胎肝基质细胞和胚胎骨髓基质细胞,采用cDNA芯片分析基因表达差异。结果流式细胞术检测发现,两组中KDR+细胞的比例为分别为:(1.06±0.20)%、(8.8±1.49)%;CD34+细胞比例为分别为:(1.25±0.16)%、(9.19±2.10)%;血岛样集落数量分别为0.9±0.36、10.6±0.63;上述结果均以骨髓基质细胞联合细胞因子诱导方法效率最高。基因芯片(hBMSCs/hFLSCs)中总共有240条基因在骨髓基质细胞中高表达,397条基因的在肝脏基质细胞中高表达。对细胞因子、细胞黏附分子以及细胞外基质蛋白的基因加以分析,结果发现在hBMSCs高表达的相关的21条基因,推测可能与造血分化相关。结论人类胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,涉及到细胞与细胞之间的相互作用,相关的细胞因子、细胞黏附分子、细胞外基质蛋白等可能起重要的作用。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 造血干细胞 基因表达
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人羊膜上皮细胞干细胞特性及向胰岛素分泌细胞分化的研究 被引量：6
2
作者 王建 彭琳 卢光琇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1484-1487,共4页
目的建立人羊膜上皮细胞(hAECs)的分离及培养方法,探讨其向胰岛素分泌细胞分化的能力。方法观察不同培养方法对hAECs生长倍增时间的影响以优化其培养体系;通过细胞免疫荧光法检测不同培养代数细胞多能干细胞的表面标记;通过体外添加诱... 目的建立人羊膜上皮细胞(hAECs)的分离及培养方法,探讨其向胰岛素分泌细胞分化的能力。方法观察不同培养方法对hAECs生长倍增时间的影响以优化其培养体系;通过细胞免疫荧光法检测不同培养代数细胞多能干细胞的表面标记;通过体外添加诱导因子的方法,探讨诱导hAECs向胰岛素分泌细胞分化的潜能。结果在10 ng表皮生长因子培养下,hAECs可长期传代。hAECs表达胚胎干细胞表面标记如阶段特异性胚胎抗原4等;采用悬浮培养法诱导分化,可检测到胰岛发育、胰岛功能基因如胰腺十二指肠同源盒、神经源素3、同源异形盒转录因子6、胰岛素、胰高糖素的表达,免疫组化检测细胞可以表达胰岛素,并且随着外界葡萄糖浓度升高,胰岛素分泌显著增加。结论建立了人羊膜上皮细胞的分离和培养方法(不添加动物血清);在体外可诱导分化为胰岛素分泌细胞。 展开更多
关键词 人羊膜上皮细胞 胰岛素分泌细胞 横向分化
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人类胚胎干细胞向造血细胞的自发分化 被引量：3
3
作者 王建 林戈 +1 位作者 赵惠萍 卢光琇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期602-605,610,共5页
目的研究人类胚胎干细胞自发向造血分化过程中造血干细胞和成熟血细胞标志出现时间,这将为胚胎干细胞定向诱导分化提供依据。方法将我所建立的人类胚胎干细胞系(chESC3)自发分化形成拟胚体,RT-PCR方法检测不同时间点造血相关基因KDR、B... 目的研究人类胚胎干细胞自发向造血分化过程中造血干细胞和成熟血细胞标志出现时间,这将为胚胎干细胞定向诱导分化提供依据。方法将我所建立的人类胚胎干细胞系(chESC3)自发分化形成拟胚体,RT-PCR方法检测不同时间点造血相关基因KDR、Bmi1、Scl、gata2等的表达、流式细胞术检测6、8、10、12d造血干细胞标志CD34表达,并通过造血集落培养方法检测这些时间点造血集落形成能力,最后将拟胚体制备石蜡切片,免疫细胞化学检测10、12、15、18d CD45阳性阳性细胞数。结果造血干细胞早期基因KDR、Bmi1在hESCs中有表达,同时该基因随着拟胚体培养时间的延长,在第4～6天开始上调表达;造血干细胞标志性基因Scl,gata2在6～8d开始表达,并且维持高表达到12d。流式细胞术检测不同时间点hEBs中CD34阳性细胞数,发现其随时间的延长有增多的趋势,6、8、10、12d分别为(1.4±0.4)%、(3.4±1.3)%、(5.5±2.2)%、(5.1%±1.7)%;6、8、10、12d的拟胚体细胞进行集落培养检测形成的集落数在每105个拟胚体细胞中分别为0、7±2、37±11、89±29,P<0.01;集落细胞表达CD45,瑞士吉姆撒染色,可以检测到分叶核粒细胞;免疫细胞化学法对10、12、15、18d拟胚体进行切片染色,发现在这4d中可以明显观察到CD45阳性细胞的出现,并随时间的延长而数量增多,分别为:0、40.5±15.09、178.6±55.89、253.0±52.04,P<0.05。结论在自发向造血细胞分化的过程中经历了3个阶段:hESCs向胚层特异性细胞分化(前6～8d);造血干祖细胞扩增期(第8～12天);成熟血细胞大量出现期(15d以后)。 展开更多
关键词 造血干细胞 胚胎干细胞 分化
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利用慢病毒载体构建稳定干扰β-catenin的人胚胎干细胞系 被引量：2
4
作者 孙懿 曾思聪 +1 位作者 卢光琇 林戈 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1088-1092,共5页
目的建立β-catenin稳定干扰的人胚胎干细胞系。方法利用β-catenin慢病毒干扰质粒PLKO.1-puro-β-catenin转染包装细胞293FT制备重组慢病毒,并感染人胚胎干细胞,采用嘌呤霉素筛选稳定表达shβ-catenin人胚胎干细胞克隆;试验分为稳定转... 目的建立β-catenin稳定干扰的人胚胎干细胞系。方法利用β-catenin慢病毒干扰质粒PLKO.1-puro-β-catenin转染包装细胞293FT制备重组慢病毒,并感染人胚胎干细胞,采用嘌呤霉素筛选稳定表达shβ-catenin人胚胎干细胞克隆;试验分为稳定转染β-catenin干扰质粒组(Shβ-catenin)、稳定转染空白载体组(VECTOR)和对照未感染组(WT)三组,RT-PCR检测干扰后β-catenin mRNA表达;进一步免疫荧光检测干扰后细胞β-catenin和OCT4的蛋白表达。结果β-catenin特异性shRNA的慢病毒感染人胚胎干细胞后,获得稳定表达shβ-catenin的人胚胎干细胞系,Shβ-catenin组β-catenin mRNA表达明显降低,只有WT组mRNA表达的1%,而VECTOR组和WT组之间无明显差异;免疫荧光染色进一步验证shβ-catenin组中基本无β-catenin蛋白的表达,但表达多能性标记OCT4。结论通过β-catenin特异性shRNA慢病毒载体构建了稳定干扰β-catenin的人胚胎干细胞系。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 RNA干扰 Β-CATENIN
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两种条件培养基促进鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞(英文) 被引量：1
5
作者 赵惠萍 卢光琇 王绮如 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期63-68,共6页
目的:从鼠胚胎干细胞获得具有造血重建功能的造血干细胞。方法:将ES-D3细胞形成4天拟胚体(4dEBs),再用骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)和/或胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM)诱导4dEBs生成造血干细胞。实验为mBMEC-CM+FLSC-CM组、mBME... 目的:从鼠胚胎干细胞获得具有造血重建功能的造血干细胞。方法:将ES-D3细胞形成4天拟胚体(4dEBs),再用骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)和/或胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM)诱导4dEBs生成造血干细胞。实验为mBMEC-CM+FLSC-CM组、mBMEC-CM组、FLSC-CM组,对照组。检测诱导生成的细胞造血干细胞特异抗原表达、造血相关基因表达、造血集落的形成以及造血重建能力。结果:从诱导ES-D3细胞生成造血干/祖细胞的数量和生成的集落总数看,mBMEC-CM+FLSC-CM组诱导效率显著高于其他3组。mBMEC-CM+FLSC-CM组诱导生成的细胞能重建照射鼠的造血系统。结论:骨髓内皮细胞条件培养液联合胎肝基质细胞条件培养液可促进鼠胚胎干细胞分化为具有造血重建能力的造血干细胞。 展开更多
关键词 胚胎 干细胞 拟胚体 造血 造血千细胞 骨髓 内皮细胞
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LFA-1和VLA-4参与人高增殖潜能内皮祖细胞与血管内皮的黏附和跨内皮迁移 被引量：7
6
作者 段华新 卢光琇 程腊梅 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2008年第3期671-675,共5页
为了了解淋巴细胞功能相关抗原1(lymphocyte function-associated antigen 1,LFA-1)和极迟反应抗原4(very late antigen 4,VLA-4)在高增殖潜能内皮祖细胞(high proliferative potential endothelial progenitor cells,HPP-EPCs)归巢过... 为了了解淋巴细胞功能相关抗原1(lymphocyte function-associated antigen 1,LFA-1)和极迟反应抗原4(very late antigen 4,VLA-4)在高增殖潜能内皮祖细胞(high proliferative potential endothelial progenitor cells,HPP-EPCs)归巢过程中与血管内皮的黏附和跨内皮迁移中的作用,利用流式细胞术检测HPP-EPC中整合蛋白β1和β2的表达以及小鼠骨髓内皮细胞相应的受体的表达。利用体外黏附和迁移实验研究经过功能级别的中和抗体阻断VLA-4和LFA-1后HPP-EPC黏附和迁移细胞数目的变化。结果表明,HPP-EPC表达整合蛋白β1和β2,活化后小鼠骨髓内皮细胞表达细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)和血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1);加CD11a抗体组黏附细胞或CD49d抗体组黏附和迁移细胞均较同型对照抗体组少,而且加CD11a和CD49d两种抗体联用组黏附和迁移细胞明显减少,其细胞数较任何单一抗体组少。结论:LFA-1和VLA-4在HPP-EPC与血管内皮的黏附和跨内皮迁移中发挥了重要的作用。 展开更多
关键词 LFA-1 VLA-4 高增殖潜能内皮祖细胞 黏附 跨内迁移
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脐血来源的两种内皮祖细胞的分离、培养和鉴定 被引量：10
7
作者 段华新 卢光琇 程腊梅 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2008年第2期387-391,共5页
为了建立从人脐血分离培养两种内皮祖细胞的方法和培养体系,从脐血分离单个核细胞,在含有内皮细胞条件培养液的体系中培养得到两种细胞,利用摄取乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low-density lipoprotein,DiI-Ac-LDL)和结合欧洲荆豆凝集... 为了建立从人脐血分离培养两种内皮祖细胞的方法和培养体系,从脐血分离单个核细胞,在含有内皮细胞条件培养液的体系中培养得到两种细胞,利用摄取乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low-density lipoprotein,DiI-Ac-LDL)和结合欧洲荆豆凝集素(Ulex European Agglutinin1,UEA-1)进行鉴定,并进一步用免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞术对它们进行内皮细胞相关的表型检测。结果表明,这两种细胞均能摄取DiI-Ac-LDL和结合UEA-1,表达内皮细胞的标志如CD31、CD144和血管假性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF),有CD31、酪氨酸激酶受体(kinase tyrosine insert domain receptor,KDR)、CD144和内皮一氧化氮合成酶(endothelial NO synthase,ENOS)的基因转录。但是,它们的增殖能力明显不同,分别称为循环成血管细胞和高增殖潜能内皮祖细胞。流式细胞计数结果显示,这两种细胞在一些表面标志表达方面也存在明显的差异。结论:利用含内皮细胞条件培养液的培养体系,成功地从脐血分离的单个核细胞中培养得到了两种内皮祖细胞。 展开更多
关键词 内皮祖细胞 脐血 内皮细胞条件培养液 细胞培养
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不同来源血清或血浆培养条件下的树突状细胞表型和功能的比较 被引量：8
8
作者 易辉君 卢光琇 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期561-563,567,共4页
目的:比较在添加100 mL/L胎牛血清(FBS)、20mL/L人AB血清和10 mL/L供者自体血浆3种不同培养条件下树突状细胞(DC)的表型和功能,为临床应用DC找到安全且有效的培养方法。方法:将外周血单个核细胞(PBMCs)分别在添加100 mL/L FBS,20 mL/L... 目的:比较在添加100 mL/L胎牛血清(FBS)、20mL/L人AB血清和10 mL/L供者自体血浆3种不同培养条件下树突状细胞(DC)的表型和功能,为临床应用DC找到安全且有效的培养方法。方法:将外周血单个核细胞(PBMCs)分别在添加100 mL/L FBS,20 mL/L人AB血清,10 mL/L供者自体血浆培养条件下诱导成DC,在培养的第8天,利用流式细胞术(FCM)检测3种培养条件下DC的得率、纯度、表型和抗原捕获能力;用MTT的方法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。结果:在DC集落数量、DC得率、DC纯度、抗原捕获能力和刺激淋巴细胞增殖的能力上,100 mL/L FBS培养组优于20 mL/L AB血清和10 mL/L自体血浆组,3组之间DC得率差异比较具有统计学的意义(P<0.05),而其他比较都无统计学的意义(P>0.05)。结论:利用供者自体血浆培养DC是一种安全有效的培养方法,符合细胞治疗规范,可替代异种血清或同种异体血清,成为临床级别DC培养的选择。 展开更多
关键词 血清 血浆 树突状细胞 表型 功能
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高效液相色谱串联质谱联用法测定培养基中丝裂霉素C残留量 被引量：2
9
作者 周菂 谭志荣 卢光琇 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期555-556,共2页
目的建立液相色谱-电喷雾串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定培养基中丝裂霉素C残留量的方法。方法培养基样品经乙腈直接沉淀蛋白后,采用Thermo Hypurity C18柱(2.1mm×150mm,5μm)分离,流速为0.2ml/min,以乙腈∶0.1%甲酸=40∶60为流动相... 目的建立液相色谱-电喷雾串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定培养基中丝裂霉素C残留量的方法。方法培养基样品经乙腈直接沉淀蛋白后,采用Thermo Hypurity C18柱(2.1mm×150mm,5μm)分离,流速为0.2ml/min,以乙腈∶0.1%甲酸=40∶60为流动相等度洗脱。通过电喷雾离子源进入质谱,以二级质谱多反应监测(MRM)方式进行检测。结果丝裂霉素的线性范围分别为0.098～50ng/ml,最低检测浓度为0.098ng/ml,平均相对回收率在91.30%～105.46%范围内,日内和日间精密度<15%。结论本法简单、快速、灵敏、重现性好,可用于丝裂霉素C的培基中残余量的测定和监控。 展开更多
关键词 液相色谱质谱联用 丝裂霉素C 人胚胎干细胞
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