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猪流行性腹泻病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用
被引量：
9
1
作者
狄亚心
谭飞
+8 位作者
秦松跃
于晓丽
崔文
姜艳平
王丽
唐丽杰
周晗
王晓娜
乔薪瑗
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第8期832-837,共6页
为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法。结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度...
为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法。结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度为61℃,反应时间为50 min,Mg2+和dNTPs浓度分别为8.0 mmol/L和4.0 mmol/L,外引物和内引物最佳浓度比为1.4。特异性试验结果显示,该方法只能检测出PEDV,对其他病原检测均为阴性,具有良好的特异性;敏感性试验结果显示,该方法能够检测出的最低RNA浓度为6.52×10^(-5)mg/L,而常规RT-PCR能检测到最低浓度为6.52×10-3mg/L,表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍;重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验结果无明显差异,重复性较好。利用RT-LAMP和RT-PCR方法分别对3份已知阳性样品,5份已知阴性样品以及52份未知临床样品进行检测。阳性样品经RT-LAMP和RT-PCR方法均检测到PEDV,阴性样品均未检测到PEDV。52份临床样品中,RT-LAMP对PEDV检测阳性率为23.08%(12/52);RT-PCR检测阳性率为17.31%(9/52),二者的符合率为94.23%。以上结果表明,建立的RT-LAMP方法具有成本低、检测快、灵敏度高、特异性强等优点。且结果易于判定、便于现场检测,在病原检测方面具有良好的应用前景,为该病的流行病学调查及综合防制提供重要的实验依据。
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关键词
猪流行性腹泻病毒
RT-LAMP
RT-PCR
诊断方法
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职称材料
猫干扰素α基因的克隆及其表达产物的抗病毒活性分析
被引量：
3
2
作者
李华
汉武娇
+4 位作者
范文禄
姜艳平
崔文
李一经
徐义刚
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第2期186-190,共5页
为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析。结果显...
为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析。结果显示,猫IFN-α有21个潜在磷酸化位点、1个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点,二级结构以α-螺旋为主。将该基因经BamH I/Kpn I酶切处理后克隆至pCold-TF载体,构建重组表达质粒pCold-α,将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞后获得了表达猫IFN-α的重组大肠杆菌pCold-α/BL21。重组菌经IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果显示重组猫IFN-α蛋白获得高效表达,采用His标签蛋白纯化柱纯化后得到纯化蛋白浓度为340 mg/L。以VSV和猫冠状病毒(FCoV)为模式病毒,采用微量细胞病变抑制法检测了重组猫IFN-α的抗病毒效果,结果显示,其抗VSV活性为5.91×10^(5) IU/mg,抗FCoV活性可达6.25×10^(6) IU/mg,具有良好的抗病毒活性。本研究为猫干扰素的开发应用奠定了物质基础。
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关键词
猫干扰素α
基因克隆
可溶性表达
抗病毒活性
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职称材料
题名
猪流行性腹泻病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用
被引量：
9
1
作者
狄亚心
谭飞
秦松跃
于晓丽
崔文
姜艳平
王丽
唐丽杰
周晗
王晓娜
乔薪瑗
机构
东北农业大学动物医学学院/黑龙江省动物疾病防控技术与制剂创制重点实验室
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第8期832-837,共6页
基金
“十三五国家重点研发计划项目”(2016YFD0500904)。
文摘
为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法。结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度为61℃,反应时间为50 min,Mg2+和dNTPs浓度分别为8.0 mmol/L和4.0 mmol/L,外引物和内引物最佳浓度比为1.4。特异性试验结果显示,该方法只能检测出PEDV,对其他病原检测均为阴性,具有良好的特异性;敏感性试验结果显示,该方法能够检测出的最低RNA浓度为6.52×10^(-5)mg/L,而常规RT-PCR能检测到最低浓度为6.52×10-3mg/L,表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍;重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验结果无明显差异,重复性较好。利用RT-LAMP和RT-PCR方法分别对3份已知阳性样品,5份已知阴性样品以及52份未知临床样品进行检测。阳性样品经RT-LAMP和RT-PCR方法均检测到PEDV,阴性样品均未检测到PEDV。52份临床样品中,RT-LAMP对PEDV检测阳性率为23.08%(12/52);RT-PCR检测阳性率为17.31%(9/52),二者的符合率为94.23%。以上结果表明,建立的RT-LAMP方法具有成本低、检测快、灵敏度高、特异性强等优点。且结果易于判定、便于现场检测,在病原检测方面具有良好的应用前景,为该病的流行病学调查及综合防制提供重要的实验依据。
关键词
猪流行性腹泻病毒
RT-LAMP
RT-PCR
诊断方法
Keywords
porcine epidemic diarrhea virus
RT-LAMP
RT-PCR
diagnostic method
分类号
S852.65 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
猫干扰素α基因的克隆及其表达产物的抗病毒活性分析
被引量：
3
2
作者
李华
汉武娇
范文禄
姜艳平
崔文
李一经
徐义刚
机构
东北农业大学动物医学学院/黑龙江省动物疾病防控技术与制剂创制重点实验室
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第2期186-190,共5页
基金
国家重点研发计划项目(2016YFD0501003)。
文摘
为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析。结果显示,猫IFN-α有21个潜在磷酸化位点、1个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点,二级结构以α-螺旋为主。将该基因经BamH I/Kpn I酶切处理后克隆至pCold-TF载体,构建重组表达质粒pCold-α,将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞后获得了表达猫IFN-α的重组大肠杆菌pCold-α/BL21。重组菌经IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果显示重组猫IFN-α蛋白获得高效表达,采用His标签蛋白纯化柱纯化后得到纯化蛋白浓度为340 mg/L。以VSV和猫冠状病毒(FCoV)为模式病毒,采用微量细胞病变抑制法检测了重组猫IFN-α的抗病毒效果,结果显示,其抗VSV活性为5.91×10^(5) IU/mg,抗FCoV活性可达6.25×10^(6) IU/mg,具有良好的抗病毒活性。本研究为猫干扰素的开发应用奠定了物质基础。
关键词
猫干扰素α
基因克隆
可溶性表达
抗病毒活性
Keywords
feline IFN-α
gene cloning
soluble expression
antiviral activity
分类号
S852.4 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
猪流行性腹泻病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用
狄亚心
谭飞
秦松跃
于晓丽
崔文
姜艳平
王丽
唐丽杰
周晗
王晓娜
乔薪瑗
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
9
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下载PDF
职称材料
2
猫干扰素α基因的克隆及其表达产物的抗病毒活性分析
李华
汉武娇
范文禄
姜艳平
崔文
李一经
徐义刚
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
3
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职称材料
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