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CHO细胞多基因工程改造策略的建立及应用 被引量：1
1
作者 程静雯 曹磊 +4 位作者 张艳敏 叶倩 陈敏 谭文松 赵亮 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期283-291,共9页
近年来,中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞工程改造主要通过敲入或敲除基因来改变细胞某个单一功能,而敲入和敲除的基因往往无法在单次实验操作中同时发挥相应的功能,限制了多基因同步改造的应用。该研究选取细胞凋亡通路... 近年来,中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞工程改造主要通过敲入或敲除基因来改变细胞某个单一功能,而敲入和敲除的基因往往无法在单次实验操作中同时发挥相应的功能,限制了多基因同步改造的应用。该研究选取细胞凋亡通路中抗凋亡蛋白即B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)基因为敲入基因、蛋白岩藻糖基化通路中岩藻糖合成关键酶即岩藻糖转移酶8(fucosyltransferase 8, FUT8)基因为敲除基因作为模型,利用CRISPR/Cas9技术建立定点同步敲入敲除基因编辑策略。利用该策略获得的单克隆细胞株Bcl-2蛋白过表达且FUT8蛋白酶功能缺失。经传代培养发现,由建立的定点同步敲入敲除基因编辑策略获得的细胞株在60 d内所编辑的基因表达稳定。相较于原野生型细胞,该细胞株表现出对血清剥夺的耐受度更高以及对死亡的抵抗能力更强。由此说明基于定点同步敲入敲除基因编辑策略具备一定可行性,可用于重组蛋白生产的CHO工程细胞株的构建。 展开更多
关键词 中国仓鼠卵巢细胞 CRISPR/Cas9 基因编辑 定点同步 细胞株构建
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支持高密度BHK-21细胞培养和高产FMD病毒的无血清培养基开发与优化 被引量：3
2
作者 陈敏 刘旭平 赵亮 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期62-71,共10页
优化无血清培养基,以实现BHK-21悬浮细胞的超高密度生长和口蹄疫病毒高效扩增。依据BHK-21细胞的代谢特点和动力学分析识别无血清培养基中的关键营养成分,优化组分浓度,对比优化前后细胞的生长和产毒能力,并在生物反应器中验证。优化后... 优化无血清培养基,以实现BHK-21悬浮细胞的超高密度生长和口蹄疫病毒高效扩增。依据BHK-21细胞的代谢特点和动力学分析识别无血清培养基中的关键营养成分,优化组分浓度,对比优化前后细胞的生长和产毒能力,并在生物反应器中验证。优化后的无血清培养基支持批培养模式下最高活细胞密度达到1.78×107 cells/mL,代谢副产物积累的情况得到改善;口蹄疫病毒TCID50与含低比例血清的培养基相比具有相似水平,约为7.25 lgTCID50/0.1mL;146s含量与低血清培养基相比提高50.7%,达到15.6μg/mL。以细胞的生长需求和代谢规律为基础,优化营养成分和降低代谢副产物积累能有效解除“细胞密度效应”,实现超高细胞密度接毒和高产口蹄疫病毒。 展开更多
关键词 BHK-21悬浮细胞 无血清培养基 高细胞密度 高产口蹄疫病毒
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生产禽流感病毒的悬浮MDCK细胞稳定性的研究 被引量：4
3
作者 白春丽 叶倩 +6 位作者 姬阿美 刘旭平 张旭 刘志亮 朱明龙 赵亮 谭文松 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期72-79,共8页
旨为研究悬浮MDCK细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性与病毒生产稳定性。以悬浮MDCK细胞为研究对象,通过对该细胞进行了长达200多天的传代培养,考察了传代过程中各代次细胞的生长情况以及对H9N2禽流感病毒的生产能力差异;探究了不同培... 旨为研究悬浮MDCK细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性与病毒生产稳定性。以悬浮MDCK细胞为研究对象,通过对该细胞进行了长达200多天的传代培养,考察了传代过程中各代次细胞的生长情况以及对H9N2禽流感病毒的生产能力差异;探究了不同培养基稀释比例和MOI等工艺参数条件对长期传代的悬浮MDCK细胞生产H9N2禽流感病毒过程的影响关系;另外,从ROS水平和细胞周期两方面,研究了高低代次细胞的病毒生产能力差异的内在原因。结果显示,各代次悬浮MDCK细胞形态相似,细胞生长能力无显著性差异,表明该细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性良好。但HA滴度随细胞代次的增加而增加,最高代次细胞(P111)的病毒滴度较最低代次细胞(P1)约高0.5 Log2HAU/100μL;P111细胞在不同工艺下病毒产量均高于P1细胞,表明了该细胞长期传代后病毒生产能力略有提高。最后,研究发现,与P1相比,P111胞内ROS水平较低并且G0/G1期细胞的比例较高,此现象可能是高代次细胞产量提高的原因。 展开更多
关键词 悬浮MDCK细胞 禽流感病毒 细胞株稳定性 ROS 细胞周期
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二氧化碳分压和渗透压升高对CHO细胞维持期生长、代谢和产物表达的影响 被引量：3
4
作者 王晨 汪嘉琪 +5 位作者 赵亮 范里 刘旭平 陈敏 张理想 谭文松 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期217-224,共8页
为了深入了解培养体系中二氧化碳分压(pCO_2)和渗透压对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产物表达的影响。考察了不同pCO_2和渗透压条件下CHO细胞的密度维持、代谢、产物表达量和产品质量(糖型修饰和电荷异质化)的情况。pCO_2和渗透压升高均对最... 为了深入了解培养体系中二氧化碳分压(pCO_2)和渗透压对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产物表达的影响。考察了不同pCO_2和渗透压条件下CHO细胞的密度维持、代谢、产物表达量和产品质量(糖型修饰和电荷异质化)的情况。pCO_2和渗透压升高均对最终抗体表达产生不利的影响,其中渗透压升高对细胞后期活性维持不利,而pCO_2升高则对产物表达期抗体比生成速率产生负面影响。通过对过程中胞内外代谢物的研究,发现pCO_2和渗透压升高均会降低碳源有效利用率。在产物的质量方面,当渗透压升高时,产物的糖基化水平下降,产物电荷分析中的中性电荷含量比例升高;而当pCO_2升高时,产物的糖型分布无明显变化,但其中中性电荷抗体含量降低。产物表达期的pCO_2和渗透压的升高对细胞维持、物质能量代谢及产物表达存在诸多不利影响,因此应尽量避免培养体系中的CO_2累积和渗透压升高的情况发生,以确保培养规模放大的正常进行。 展开更多
关键词 二氧化碳分压 渗透压 CHO细胞 单克隆抗体 代谢
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BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒 被引量：3
5
作者 姬阿美 白春丽 +4 位作者 叶倩 周燕 刘旭平 谭文松 刘志亮 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期114-121,共8页
为建立基于无血清悬浮培养细胞生产新城疫病毒(NDV)的工艺,本研究首先筛选了适于NDV增殖的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)单克隆细胞株,并将鸡胚适应的NDV在筛选获得的细胞株(BHK-v002)中传代,获得细胞适应的NDV。进一步采用单因素实验法检测病... 为建立基于无血清悬浮培养细胞生产新城疫病毒(NDV)的工艺,本研究首先筛选了适于NDV增殖的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)单克隆细胞株,并将鸡胚适应的NDV在筛选获得的细胞株(BHK-v002)中传代,获得细胞适应的NDV。进一步采用单因素实验法检测病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、细胞培养液的稀释比例等工艺参数对病毒效价的影响。结果显示,NDV在无血清培养的BHK-v002细胞中增殖的最适条件为:当细胞生长至约9.0×10^6个/mL时,以培养液.新鲜培养基为2:1的比例补加新鲜培养基,使细胞密度达6.0×10^6个/m L,按MOI为0.005接种NDV LaSota株,TPCK-胰酶终浓度为5μg/mL。接种病毒后96 h收获病毒液的HA效价为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量(Svy)达到1 685.9病毒颗粒/细胞,半数组织细胞感染剂量(TCID50)为7.9 log10TCID50/100μL。本研究确定了NDV LaSota株在BHK-21细胞悬浮培养中的增殖条件,建立了基于BHK-21细胞无血清悬浮培养体系中NDV的生产工艺,该工艺操作简便,易于放大,为当前ND疫苗的鸡胚生产工艺提供了候选替代方案。 展开更多
关键词 NDV BHK-21细胞 无血清 悬浮培养 增殖条件
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猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中的表达和免疫原性分析 被引量：3
6
作者 张艳敏 周亚南 +4 位作者 曹磊 田园 刘旭平 谭文松 赵亮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第2期669-676,共8页
【目的】设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性,为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆... 【目的】设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性,为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH,将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒,转导HEK293T细胞,经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定,得到大小分别为8172 bp的载体片段和1521 bp的E2-GM-CSF基因片段,表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体;细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1686 bp的条带,表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组;Western blotting分析获得约70 ku的条带,证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达;SDS-PAGE验证显示,纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带,纯度较高,大小约70 ku;小鼠免疫血清ELISA检测结果表明,表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性,免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体,免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900,免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8100,远高于E2蛋白的1∶1800。【结论】利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白,为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗,同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。 展开更多
关键词 猪瘟病毒(CSFV) E2-GM-CSF融合蛋白 慢病毒载体表达系统 HEK293T细胞 免疫原性
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全悬浮MDCK细胞驯化与H9亚型禽流感疫苗毒种制备 被引量：2
7
作者 赖汉漳 谭文松 +10 位作者 詹烜子 刘旭平 麦康聪 刘玉鹏 汤钦 盘伟岚 王小芬 陈华坚 陈培军 许东蕾 陈瑞爱 《广东畜牧兽医科技》 2021年第6期45-49,共5页
为了研制悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗,笔者对细胞和疫苗毒种进行了驯化。将贴壁的MDCK细胞利用直接适应无血清法经过方瓶预驯化3代、摇瓶培养驯化13代得到了一株适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系,命名为MDCK(DHN)细胞系。该细胞密... 为了研制悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗,笔者对细胞和疫苗毒种进行了驯化。将贴壁的MDCK细胞利用直接适应无血清法经过方瓶预驯化3代、摇瓶培养驯化13代得到了一株适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系,命名为MDCK(DHN)细胞系。该细胞密度高,呈单个分散生长,形态饱满,大小均一,活性强。在此基础上,将H9亚型禽流感CN株鸡胚毒通过悬浮MDCK(DHN)细胞连续传代驯化9代后得到了在细胞中稳定、高效复制的CN株细胞毒,并且该CN株细胞毒与CN株鸡胚毒在抗原性和免疫原性等生物学特性均保持了一致。本研究成功研制了可用于悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗生产的MDCK(DHN)悬浮细胞系和细胞毒种。 展开更多
关键词 MDCK细胞 无血清全悬浮培养 禽流感病毒 驯化
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无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响
8
作者 周伟 刘旭平 +3 位作者 张艳敏 彭雯娟 赵亮 谭文松 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2397-2405,共9页
【目的】建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗的工艺,提高PCV2疫苗生产效率,降低PCV2疫苗生产成本。【方法】首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化,并在无血清悬浮培养体系下,采用... 【目的】建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗的工艺,提高PCV2疫苗生产效率,降低PCV2疫苗生产成本。【方法】首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化,并在无血清悬浮培养体系下,采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数(MOI)(0.10、0.05、0.01和0.001)和不同PK-15细胞接种密度(CDI)(1.0×10^(6)、3.0×10^(6)、5.0×10^(6)/mL)对PCV2增殖的影响,同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养,且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^(-1)增加到0.6 d^(-1);悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代,连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^(-1)附近波动,且细胞活率始终>90%;以1.0×10^(6)/mL接种,第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10^(6)/mL,并可维持1 d,第4天前活率均>90%,此后快速下降;病毒增殖最佳工艺参数为:感染复数为0.05,细胞接种密度为1.0×10^(6)/mL,最终收获时病毒滴度可达10^(6.2)TCID_(50)/mL;对细胞感染前后的代谢分析发现,病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前,且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累,之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株,PK-15细胞可用于PCV2增殖,结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。 展开更多
关键词 PK-15细胞 无血清悬浮培养 猪圆环病毒2型(PCV2) 增殖 氨基酸代谢
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柠檬酸铁铵对悬浮HEK293细胞转染的影响机制探究
9
作者 陈中元 王玉红 +5 位作者 代为俊 张艳敏 叶倩 刘旭平 谭文松 赵亮 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期311-318,共8页
基于聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的悬浮人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)转染技术前景广阔,但培养基组分会影响转染效率。简单的离心换液存在污染风险,且影响细胞状态。探究抑制转染效率的关键组分对转染... 基于聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的悬浮人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)转染技术前景广阔,但培养基组分会影响转染效率。简单的离心换液存在污染风险,且影响细胞状态。探究抑制转染效率的关键组分对转染过程的影响机制,有利于从根本上解决该问题。首先通过探究培养基中对转染效率具有潜在影响的组分确定关键组分柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)的抑制作用,然后通过考察柠檬酸铁铵添加对细胞状态、PEI与DNA形成的复合物(PEI-DNA complex,PEI-DNA复合物)结合情况、目的基因表达情况的影响,分析其抑制转染效率的机制。结果表明,高浓度的柠檬酸铁铵对细胞转染存在明显抑制作用,且该抑制作用随着柠檬酸铁铵浓度的升高而逐渐增强。当柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制细胞转染过程。过高浓度的柠檬酸铁铵使PEI-DNA复合物的粒径显著增加,复合物进入细胞更加困难,导致进入细胞的复合物数量减少,最终引起细胞转染效率的大幅下降。柠檬酸铁铵通过影响PEI-DNA复合物的大小限制DNA进入细胞,从而抑制PEI介导的悬浮HEK293细胞转染过程。控制转染时柠檬酸铁铵浓度在20μmol/L内可解决其对转染过程的抑制作用。本研究深入认识了柠檬酸铁铵对PEI介导的悬浮HEK293细胞转染过程的影响及其机制,为悬浮HEK293细胞转染培养基的开发和理性设计提供有力参考。 展开更多
关键词 悬浮HEK293细胞 转染效率 柠檬酸铁铵 PEI介导的转染 哺乳动物细胞瞬时表达系统
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