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慢病毒介导稳定表达HBcAg的P815/c细胞株的建立及鉴定 被引量:1
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作者 戴胜兰 卓萌 +1 位作者 汤正好 臧国庆 《科学技术与工程》 北大核心 2017年第6期147-151,共5页
研究旨在建立稳定表达HBcAg的P815/c細胞株,为评价针对HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供体外感染的细胞模型。通过构建携带HBcAg基因的慢病毒表达载体质粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,载体质粒携帯有加强型绿色荧光蛋白(eGFP)... 研究旨在建立稳定表达HBcAg的P815/c細胞株,为评价针对HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供体外感染的细胞模型。通过构建携带HBcAg基因的慢病毒表达载体质粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,载体质粒携帯有加强型绿色荧光蛋白(eGFP)及嘌呤霉素(Puromycin)抗性标记基因,与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒pLP/VSVG共转染人胚肾293T细胞进行包装,得到携帯有HBcAg基因的重组慢病毒颗粒LV-HBcAg-Puro。经纯化、鉴定后转染小鼠肥大瘤细胞株P815细胞72h后,通过加入并维持2μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞,药物筛选约10 d后,免疫荧光及流式细胞仪检测表达GFP的细胞比例在98%以上,Western Blot可检测到转染后细胞内HBcAg的蛋白表达。成功构建稳定表达HBcAg基因的细胞株P815/C,为研究小鼠体内针对HBcAg的疫苗诱发的CTL反应提供了细胞杀伤实验的靶细胞。 展开更多
关键词 慢病毒 乙型肝炎核心抗原 P815细胞株
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乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建 被引量:1
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作者 沈楠 余永胜 +3 位作者 潘庆春 陈小华 臧国庆 汤正好 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1121-1124,共4页
目的构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其... 目的构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1(-),并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒核心抗原 DNA疫苗 泛素 融合基因
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恩替卡韦联合苦参素改善HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者Th1/Th2失平衡临床研究 被引量:16
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作者 张毅 余永胜 +5 位作者 汤正好 陈小华 王鹏 江红 奚敏 臧国庆 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2016年第10期1168-1172,共5页
目的:探讨恩替卡韦联合苦参素对HBe Ag阳性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者Th1/Th2失平衡的影响。方法:将216例HBe Ag阳性CHB患者随机分为治疗组和对照组。治疗组112例给予恩替卡韦联合苦参素治疗,对照组104例给予恩替卡韦治... 目的:探讨恩替卡韦联合苦参素对HBe Ag阳性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者Th1/Th2失平衡的影响。方法:将216例HBe Ag阳性CHB患者随机分为治疗组和对照组。治疗组112例给予恩替卡韦联合苦参素治疗,对照组104例给予恩替卡韦治疗,疗程48周。治疗48周后,应用ELISA检测患者外周血Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2)和Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)的表达水平,应用实时定量PCR检测患者外周血Th1细胞特征性转录因子(T-bet)和Th2细胞特征性转录因子(GATA3)mRNA的表达水平。结果:治疗48周后,治疗组IFN-γ、IL-2的表达水平较对照组明显升高[(68.32±9.67)pg/m L vs(35.24±7.49)pg/m L,(216.81±31.55)pg/m L vs(115.63±29.13)pg/m L;t1=27.96,t2=24.43;P1、P2均<0.01];而治疗组IL-4、IL-10的表达水平较对照组明显降低[(18.79±5.83)pg/m L vs(22.58±5.32)pg/m L,(133.75±29.21)pg/m L vs(143.17±32.96)pg/m L;t3=4.98,t4=2.23;P3<0.01,P4<0.05]。治疗组IFN-γ与IL-4比值IFN-γ/IL-4较对照组明显增大(3.59±0.76 vs 1.61±0.53,t=22.05,P<0.01)。治疗48周后,治疗组T-bet mRNA的表达水平较对照组明显升高(1.52±0.41 vs 0.83±0.29,t=14.18,P<0.01);而治疗组GATA3 mRNA的表达水平较对照组明显降低(0.96±0.24 vs 1.05±0.37,t=2.14,P<0.05)。治疗组T-bet mRNA与GATA3 mRNA比值T-bet/GATA3较对照组明显增大(1.60±0.39 vs 0.81±0.32,t=16.20,P<0.01)。结论:恩替卡韦联合苦参素可以促进HBe Ag阳性CHB患者Th1型细胞因子的分泌,抑制Th2型细胞因子的分泌,促使HBe Ag阳性CHB患者外周血Th细胞向Th1细胞分化,使其Th1/Th2失平衡得到改善。 展开更多
关键词 慢性乙型肝炎 恩替卡韦 苦参素 TH1细胞 TH2细胞 细胞因子
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乙肝肝硬化患者联合检测血清视黄醇结合蛋白、前白蛋白和白蛋白的临床价值 被引量:14
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作者 张毅 余永胜 +3 位作者 汤正好 江红 奚敏 臧国庆 《临床肝胆病杂志》 CAS 2009年第6期422-424,共3页
目的联合检测视黄醇结合蛋白(RBP)、前白蛋白(PA)和白蛋白(ALB)在乙肝肝硬化患者中的血清水平变化,探讨三者的相关性及临床价值。方法应用免疫透射比浊法检测89例乙肝肝硬化患者和35例健康成年人的血清RBP与PA水平,溴甲酚绿法检测血清AL... 目的联合检测视黄醇结合蛋白(RBP)、前白蛋白(PA)和白蛋白(ALB)在乙肝肝硬化患者中的血清水平变化,探讨三者的相关性及临床价值。方法应用免疫透射比浊法检测89例乙肝肝硬化患者和35例健康成年人的血清RBP与PA水平,溴甲酚绿法检测血清ALB水平。结果乙肝肝硬化患者的血清RBP、PA和ALB水平均显著低于正常对照组(P<0.01)。血清RBP与PA水平呈正相关(r=0.743,P<0.01),血清RBP、PA亦分别与ALB水平呈正相关(r1=0.602,r2=0.529,P均<0.01)。结论血清RBP、PA和ALB水平与肝功能损害程度相关,可以作为反映肝功能损害程度的指标,而RBP与PA比ALB能更灵敏地反映肝功能损害程度的变化。三者联合检测能更好地判断乙肝肝硬化患者的肝功能状况。 展开更多
关键词 视黄醇结合蛋白 前白蛋白 白蛋白 乙肝肝硬化
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CTLA-4 siRNA对慢性乙型肝炎患者外周血Th1/Th2细胞因子的影响 被引量:5
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作者 余永胜 吴昊 +1 位作者 汤正好 臧国庆 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2011年第5期553-558,共6页
目的:观察化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者外周血淋巴细胞细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lympho-cyte antigen 4,CTLA-4)表达的抑制作用及干扰后对细胞因子IFN-... 目的:观察化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者外周血淋巴细胞细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lympho-cyte antigen 4,CTLA-4)表达的抑制作用及干扰后对细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4分泌的影响,探讨CTLA-4对慢性乙型肝炎的T细胞免疫调节作用。方法:检测CHB患者外周血淋巴细胞CTLA-4,观察其与HBV-DNA的相关性(P<0.05);根据人淋巴细胞CTLA-4的基因序列,设计合成CTLA-4 siRNA及阴性对照siRNA(siR-NA-co),电穿孔法转染CHB患者外周血淋巴细胞,采用实时荧光定量PCR(real-time Q-PCR)方法检测淋巴细胞CTLA-4 mRNA的表达,采用Western Blotting检测淋巴细胞CTLA-4蛋白表达,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedim-muno sorbent assay,ELISA)检测IFN-γ、IL-2和IL-4分泌。结果:CHB患者外周血淋巴细胞CTLA-4表达量与血清HBV-DNA载量有关;CTLA-4 siRNA转染CHB患者外周血淋巴细胞后,CTLA-4 mRNA及CTLA-4蛋白表达均受到抑制,IFN-γ、IL-2分泌增加,与阴性对照相比差异具有统计学意义(P<0.01)。而IL-4分泌没有变化,与阴性对照相比差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:CHB患者外周血淋巴细胞CTLA-4表达一定程度抑制免疫反应,利于HBV-DNA的复制;利用siRNA在mRNA水平抑制CHB患者外周血淋巴细胞CTLA-4的表达,能够诱导Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ分泌增加,对Th2型细胞因子IL-4无影响。说明抑制CTLA4有助于慢性乙型肝炎患者T细胞免疫的增强。 展开更多
关键词 慢性乙型肝炎 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 SIRNA TH1/TH2
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阻断Notch1信号通路对慢性乙肝患者外周血T细胞免疫功能的影响 被引量:2
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作者 刘雪妮 裴金仙 +2 位作者 李小亮 臧国庆 余永胜 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2011年第2期174-179,共6页
目的:观察阻断Notch1信号对慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)T-bet表达,Th1和Th2型细胞因子表达以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞毒活性的影响,探讨Notch1信号通路在调节慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T细胞免疫功能的作用... 目的:观察阻断Notch1信号对慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)T-bet表达,Th1和Th2型细胞因子表达以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞毒活性的影响,探讨Notch1信号通路在调节慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T细胞免疫功能的作用。方法:将慢性乙型病毒性肝炎患者PBMC随机分为实验组,阴性对照组和空白对照组,分别给予抗-Notch1,IgG2b和RPMI-1640培养液,采用实时荧光定量PCR(real-time Q-PCR)检测各组T-bet mRNA的表达情况,采用ELISA法检测Th1型细胞因子IFN-γ,IL-2和Th2型细胞因子IL-4,IL-10的分泌水平,采用乳酸脱氢酶释放法检测CTL对靶细胞HepG2.2.15细胞毒活性的变化。结果:用抗体阻断Notch1信号通路后,慢性乙型病毒性肝炎患者PBMC中T-bet mRNA表达增强,Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2浓度增高,而Th2型细胞因子IL-4和IL-10浓度减少,且CTL细胞毒活性明显增强,与阴性对照组和空白对照组相比差异有统计学意义(P均<0.01)。结论:阻断Notch1信号通路可增强慢性乙肝患者PBMC中T-bet mRNA表达,使Th1型细胞因子分泌增加,Th2型细胞因子分泌减少,且使CTL细胞毒活性增强,说明阻断Notch1信号通路可增强慢性乙肝患者T细胞免疫反应,Notch1信号通路可能参与慢性乙型病毒性肝炎患者机体的免疫耐受,且可能与T-bet有关。 展开更多
关键词 慢性乙肝 NOTCH1 T细胞免疫 T-BET CTL
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人源性抗HBc单链抗体真核表达载体的构建及其细胞内表达 被引量:1
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作者 汤正好 臧国庆 +4 位作者 马会慧 余永胜 江红 李刚 姚集鲁 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期915-918,共4页
目的构建人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体并在细胞内表达。方法采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因插入真核表达载体pEGFP-c1;转染HepG2细胞,经G418筛选细胞,荧光倒置显微镜观察细胞内抗HBc单链抗体与绿色荧光蛋白融合... 目的构建人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体并在细胞内表达。方法采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因插入真核表达载体pEGFP-c1;转染HepG2细胞,经G418筛选细胞,荧光倒置显微镜观察细胞内抗HBc单链抗体与绿色荧光蛋白融合表达情况,并用ELISA法检测HBc单链抗体基因的细胞内表达。结果成功地构建了人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体。转染HepG2细胞并筛选后,经荧光倒置显微镜观察,细胞内有绿色荧光蛋白表达;ELISA检测细胞内表达的单链抗体片段具有HBcAg结合活性。结论人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体的构建并在细胞内成功表达,为胞内抗HBc单链抗体的进一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 肝炎核心蛋白 乙型 基因表达 HEPG2细胞
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CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin联合佐剂CpG ODN免疫转基因小鼠的免疫应答研究 被引量:1
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作者 吴姗姗 唐余燕 +5 位作者 陈小华 张毅 王洁玲 汤正好 臧国庆 余永胜 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2018年第3期271-276,共6页
目的:观察以非甲基化寡聚脱氧核苷酸基序(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)为佐剂联合融合蛋白胞质转导肽(CTP)-HBc Ag18-27-Tapasin免疫乙型病毒性肝炎(hepatitis B virus,HBV)转基因小鼠的免疫反应。方法:HBV转基因小鼠随机分为5组... 目的:观察以非甲基化寡聚脱氧核苷酸基序(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)为佐剂联合融合蛋白胞质转导肽(CTP)-HBc Ag18-27-Tapasin免疫乙型病毒性肝炎(hepatitis B virus,HBV)转基因小鼠的免疫反应。方法:HBV转基因小鼠随机分为5组,实验组:CTP-HBc Ag18-27-Tapasin+CpG ODN组,对照组:CTP-HBc Ag18-27-Tapasin,干扰素(IFN-α)组,CpG ODN组,空白组为生理盐水组。融合蛋白及CpG ODN经肌肉注射免疫小鼠,流式细胞仪检测病毒特异性T细胞反应(HBV-specific cytotoxic T cell,CTL)变化,全自动免疫分析仪检测血清乙肝表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBs Ag)水平,ELISA检测T淋巴细胞培养上清白介素(IL)-2、γ-干扰素(IFN-γ)水平,实时荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测HBV DNA水平,免疫组化观察HBV转基因小鼠肝脏中HBs Ag水平。结果:CTP-HBc Ag18-27-Tapasin+CpG ODN组中IFN-γ+CD8+双阳性T细胞百分比增高,细胞培养上清IL-2、IFN-γ水平升高,肝脏病理显示炎性细胞增多,免疫组化显示HBs Ag表达水平明显下降,同时对血清HBs Ag及HBV DNA水平进行比较,CTP-HBc Ag18-27-Tapasin有明显抑制作用。结论:CpG-ODN作为佐剂可以增强融合蛋白CTP-HBc Ag18-27-Tapasin诱导的HBV转基因小鼠抗病毒免疫应答。 展开更多
关键词 胞质转导肽 抗病毒反应 佐剂
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