目的·探究KRAS靶向抑制剂索托拉西布(sotorasib)获得性耐药肺癌细胞的代谢特征及代谢重编程规律。方法·构建肺癌细胞H2122和H358的索托拉西布获得性耐药细胞模型(H2122-SR和H358-SR细胞),并采用CCK-8法加以验证。应用超高效...目的·探究KRAS靶向抑制剂索托拉西布(sotorasib)获得性耐药肺癌细胞的代谢特征及代谢重编程规律。方法·构建肺癌细胞H2122和H358的索托拉西布获得性耐药细胞模型(H2122-SR和H358-SR细胞),并采用CCK-8法加以验证。应用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)分析获得性耐药肺癌细胞及其同源亲本细胞的代谢轮廓,利用主成分分析法和偏最小二乘法-判别分析法等统计学方法进行非靶向代谢组学分析及代谢表征,筛选并鉴定索托拉西布获得性耐药相关的差异代谢物,并对所筛选到的差异代谢物进行通路富集分析。通过绘制热图比较分析主要差异代谢通路上的代谢物在耐药细胞与亲本细胞之间的差异。结果·成功构建H2122和H358细胞的获得性耐药细胞模型,对索托拉西布的半数抑制浓度均较亲本细胞提升50倍以上。与亲本细胞相比,耐药细胞代谢轮廓存在显著差异。H2122-SR与H2122细胞之间发现48种差异代谢物,其中变量投影重要程度(variable importance in the projection,VIP)值排名前10位的差异代谢物为尿嘧啶、黄苷酸、吲哚-3-甲酸、烟酸、黄苷、黄嘌呤、N-甲基烟酰胺、次黄嘌呤、葫芦巴碱、半乳糖醛酸;H358-SR与H358细胞之间发现79种差异代谢物,其中VIP值排名前10位的差异代谢物为还原型谷胱甘肽、黄苷、α-酮戊二酸、羧甲基赖氨酸、胸苷、嘌呤、核黄素、3-吲哚丙烯酸、吲哚-3-丙酮酸、二氢尿嘧啶。2种肺癌细胞系的差异代谢通路主要涉及嘌呤代谢和糖酵解/糖异生,其中嘌呤代谢变化最为显著。热图分析显示,耐药细胞嘌呤代谢途径多数代谢物水平升高。结论·索托拉西布获得性耐药的肺癌细胞嘌呤代谢增强。展开更多
文摘目的·探究KRAS靶向抑制剂索托拉西布(sotorasib)获得性耐药肺癌细胞的代谢特征及代谢重编程规律。方法·构建肺癌细胞H2122和H358的索托拉西布获得性耐药细胞模型(H2122-SR和H358-SR细胞),并采用CCK-8法加以验证。应用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)分析获得性耐药肺癌细胞及其同源亲本细胞的代谢轮廓,利用主成分分析法和偏最小二乘法-判别分析法等统计学方法进行非靶向代谢组学分析及代谢表征,筛选并鉴定索托拉西布获得性耐药相关的差异代谢物,并对所筛选到的差异代谢物进行通路富集分析。通过绘制热图比较分析主要差异代谢通路上的代谢物在耐药细胞与亲本细胞之间的差异。结果·成功构建H2122和H358细胞的获得性耐药细胞模型,对索托拉西布的半数抑制浓度均较亲本细胞提升50倍以上。与亲本细胞相比,耐药细胞代谢轮廓存在显著差异。H2122-SR与H2122细胞之间发现48种差异代谢物,其中变量投影重要程度(variable importance in the projection,VIP)值排名前10位的差异代谢物为尿嘧啶、黄苷酸、吲哚-3-甲酸、烟酸、黄苷、黄嘌呤、N-甲基烟酰胺、次黄嘌呤、葫芦巴碱、半乳糖醛酸;H358-SR与H358细胞之间发现79种差异代谢物,其中VIP值排名前10位的差异代谢物为还原型谷胱甘肽、黄苷、α-酮戊二酸、羧甲基赖氨酸、胸苷、嘌呤、核黄素、3-吲哚丙烯酸、吲哚-3-丙酮酸、二氢尿嘧啶。2种肺癌细胞系的差异代谢通路主要涉及嘌呤代谢和糖酵解/糖异生,其中嘌呤代谢变化最为显著。热图分析显示,耐药细胞嘌呤代谢途径多数代谢物水平升高。结论·索托拉西布获得性耐药的肺癌细胞嘌呤代谢增强。
文摘目的·研究不同亚型G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase,GRK)在毒蕈碱型乙酰胆碱受体1(muscarinic acetylcholine receptor 1,M1受体)介导的偏向性信号转导过程中的作用机制,重点关注其调控M1受体与下游异源三聚体G蛋白(Gα_(q)-Gβ_(1)-Gγ_(2))及β-抑制蛋白2(β-arrestin 2,βarr2)结合的分子效应。方法·构建基于生物发光能量共振转移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)的高灵敏度蛋白互作检测系统,选取6种结构及功能各异的M1受体激动剂/变构调节剂,系统测定在不同激动剂/变构调节剂刺激下M1受体与4种GRK亚型(GRK2/3/5/6)、βarr2以及G蛋白之间的动态相互作用。所有BRET实验数据均采用时间-效应曲线的曲线下面积(area under the curve,AUC)进行量化统计。首先,通过梯度浓度激动剂/变构调节剂处理及AUC拟合,建立浓度-效应曲线,综合分析各激动剂/变构调节剂相较于内源性激动剂氯化乙酰胆碱(acetylcholine chloride,ACh),在促进M1受体与GRK3/5、βarr2及G蛋白相互作用方面的效能差异;然后,将GRK按亚型类别分为GRK2/3和GRK5/62组,分别计算高浓度条件下M1受体与2类GRK互作的最大AUC值,进而评估不同类型GRK对M1受体与βarr2或G蛋白结合强度的调控倾向。结果·6种激动剂/变构调节剂均能有效诱导M1受体与GRK3的结合,但是它们也均能引起M1受体与GRK5发生解离;变构调节剂BQCA不仅能单独激活M1受体并引发其与下游信号转导蛋白的结合,还在与ACh联合处理时,使M1-G蛋白和M1-βarr2体系的浓度-效应曲线显著左移,提示其对ACh增幅作用主要是通过减小半数效应浓度;7组药物诱导的M1-βarr2与M1-G蛋白互作最大AUC之间存在中度正相关(r=0.722),但无统计学意义(P=0.067);进一步分析表明,M1-GRK2/3与M1-GRK5/6互作最大AUC的比值,和M1-βarr2与M1-G蛋白互作最大AUC的比值同样呈正相关(r=0.760,P=0.047)。结论·M1受体可能在基础状态下即与GRK5/6预先结合,受体激动后两者解离,提示GRK5/6可能参与M1受体的失活或信号重编程;M1受体对不同GRK亚型的相对作用效率决定了其下游信号通路的偏好。
