目的·研究血浆外泌体来源的microRNA(miRNA),为结核病的诊断寻找潜在标志物。方法·采用卡介苗(Bacille CalmetteGuérin,BCG,即减毒牛分枝结核杆菌)感染人单核细胞白血病细胞(THP-1)来源的巨噬细胞(BCG组),设置未感染细...目的·研究血浆外泌体来源的microRNA(miRNA),为结核病的诊断寻找潜在标志物。方法·采用卡介苗(Bacille CalmetteGuérin,BCG,即减毒牛分枝结核杆菌)感染人单核细胞白血病细胞(THP-1)来源的巨噬细胞(BCG组),设置未感染细胞为对照组。利用超速离心法获取2组细胞培养上清液中的外泌体,通过透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、蛋白质印迹法进行形态学及蛋白标志物鉴定,并对外泌体进行转录组测序分析。选取测序结果中的3个差异表达miRNAs,就10例结核病患者(结核病组)和8例健康志愿者(健康对照组)的血浆外泌体进行临床验证。通过TargetScan、miRDB和PicTar数据库对存在潜在差异表达的miRNA进行靶基因预测。结果·细胞培养上清液外泌体测序结果显示,与对照组相比,miRNA-323a-3p、miRNA-29a-3p和miRNA-29b-3p在BCG组的表达均有显著差异,而在临床验证中仅有miRNA-323a-3p在2组表达间的差异具有统计学意义(P=0.004);且miRNA-323a-3p在结核患者血浆来源的外泌体中显著下调,与转录组结果一致。结论·血浆外泌体来源的miRNA-323a-3p在结核患者中的表达显著下调,且其靶基因与自噬作用密切相关,有望为结核病的机制研究提供新思路。展开更多
目的·验证基于SMART(switching mechanism at 5'end of RNA template)技术自制的转录组测序文库构建试剂(DIY试剂)替代昂贵的商业化试剂TaKaRa SMART-Seq v4试剂盒(TaKaRa试剂)的可行性。方法·选取4只8周龄雌性C57BL/6小...目的·验证基于SMART(switching mechanism at 5'end of RNA template)技术自制的转录组测序文库构建试剂(DIY试剂)替代昂贵的商业化试剂TaKaRa SMART-Seq v4试剂盒(TaKaRa试剂)的可行性。方法·选取4只8周龄雌性C57BL/6小鼠,随机分为2组:一组作为对照组,不进行处理;另一组向小鼠腹腔内注射1 mL浓度为4%的巯基乙酸盐肉汤,诱导巨噬细胞。经过72 h后,分离腹腔巨噬细胞并提取RNA,用DIY试剂和TaKaRa试剂分别进行cDNA文库的构建。经二代测序后,利用生物信息学分析方法从数据质量、基因差异表达分析、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析3个方面探究不同建库试剂对转录组测序结果的影响。结果·DIY试剂和TaKaRa试剂处理的样品数据质量良好;2种试剂捕获转录本的能力相近;样品所测序列在基因上的覆盖度均匀且一致性较高;差异表达基因以及通路富集的分析结果基本一致。结论·DIY试剂可替代TaKaRa试剂进行少量细胞的转录组测序文库构建,并降低建库成本。展开更多
文摘目的·研究血浆外泌体来源的microRNA(miRNA),为结核病的诊断寻找潜在标志物。方法·采用卡介苗(Bacille CalmetteGuérin,BCG,即减毒牛分枝结核杆菌)感染人单核细胞白血病细胞(THP-1)来源的巨噬细胞(BCG组),设置未感染细胞为对照组。利用超速离心法获取2组细胞培养上清液中的外泌体,通过透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、蛋白质印迹法进行形态学及蛋白标志物鉴定,并对外泌体进行转录组测序分析。选取测序结果中的3个差异表达miRNAs,就10例结核病患者(结核病组)和8例健康志愿者(健康对照组)的血浆外泌体进行临床验证。通过TargetScan、miRDB和PicTar数据库对存在潜在差异表达的miRNA进行靶基因预测。结果·细胞培养上清液外泌体测序结果显示,与对照组相比,miRNA-323a-3p、miRNA-29a-3p和miRNA-29b-3p在BCG组的表达均有显著差异,而在临床验证中仅有miRNA-323a-3p在2组表达间的差异具有统计学意义(P=0.004);且miRNA-323a-3p在结核患者血浆来源的外泌体中显著下调,与转录组结果一致。结论·血浆外泌体来源的miRNA-323a-3p在结核患者中的表达显著下调,且其靶基因与自噬作用密切相关,有望为结核病的机制研究提供新思路。
文摘目的·验证基于SMART(switching mechanism at 5'end of RNA template)技术自制的转录组测序文库构建试剂(DIY试剂)替代昂贵的商业化试剂TaKaRa SMART-Seq v4试剂盒(TaKaRa试剂)的可行性。方法·选取4只8周龄雌性C57BL/6小鼠,随机分为2组:一组作为对照组,不进行处理;另一组向小鼠腹腔内注射1 mL浓度为4%的巯基乙酸盐肉汤,诱导巨噬细胞。经过72 h后,分离腹腔巨噬细胞并提取RNA,用DIY试剂和TaKaRa试剂分别进行cDNA文库的构建。经二代测序后,利用生物信息学分析方法从数据质量、基因差异表达分析、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析3个方面探究不同建库试剂对转录组测序结果的影响。结果·DIY试剂和TaKaRa试剂处理的样品数据质量良好;2种试剂捕获转录本的能力相近;样品所测序列在基因上的覆盖度均匀且一致性较高;差异表达基因以及通路富集的分析结果基本一致。结论·DIY试剂可替代TaKaRa试剂进行少量细胞的转录组测序文库构建,并降低建库成本。
