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牙龈素提取物对口腔鳞癌细胞HN6生物学特性的影响
1
作者 李虎虓 李笑甜 +3 位作者 赵旭日 张桓瑜 周薇 宋忠臣 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期161-168,共8页
目的·观察牙龈素提取物对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞HN6生物学特性的影响。方法·选取人OSCC细胞系HN6,加入牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)牙龈素提取物进行培养。根据... 目的·观察牙龈素提取物对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞HN6生物学特性的影响。方法·选取人OSCC细胞系HN6,加入牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)牙龈素提取物进行培养。根据牙龈素提取物的蛋白浓度不同分为对照组(control组),及牙龈素提取物蛋白浓度3.125μg/mL组、6.25μg/mL组、12.5μg/mL组、25μg/mL组、50μg/mL组和100μg/mL组,培养24、48 h后,采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测牙龈素提取物对HN6细胞增殖活性的影响。后续其他实验,分为control组、25μg/mL组和50μg/mL组进行。通过流式细胞术检测牙龈素提取物对细胞周期的影响,划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和Western blotting检测细胞E-cadherin和N-cadherin蛋白和基因的表达。结果·在牙龈素提取物刺激HN6细胞24 h时,相比较control组,牙龈素提取物蛋白浓度25μg/mL组(P=0.025),50μg/mL组(P=0.000)和100μg/mL组(P=0.049)的HN6细胞增殖活性显著增加;当刺激48 h时,6.25μg/mL组(P=0.024)、12.5μg/mL组(P=0.006)、25μg/mL组(P=0.000)、50μg/mL组(P=0.000)和100μg/mL组(P=0.000)均较control组HN6细胞增殖活性有显著增加。细胞周期检测结果显示,与control组相比,经牙龈素提取物刺激24 h,HN6细胞G1期比例下降,S+G2期比例显著性上升(25μg/mL组:P=0.024;50μg/mL组:P=0.001)。细胞迁移实验结果显示,与control组相比,随着牙龈素提取物浓度升高,划痕愈合的百分比显著增加(P=0.001)。细胞Transwell侵袭实验结果显示,与control组相比,随着牙龈素提取物浓度升高,细胞穿过小室底部的数量显著性增加。RT-PCR和Western blotting实验结果显示,与control组相比,随着牙龈素提取物浓度增加,HN6细胞中N-cadherin mRNA和蛋白表达量显著性增加,E-cadherin mRNA和蛋白表达量显著性减少。结论·牙龈素提取物对OSCC细胞HN6的增殖、迁移和侵袭有促进作用。 展开更多
关键词 牙龈素 牙周炎 口腔鳞状细胞癌 细胞增殖 细胞迁移 细胞侵袭
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Th17细胞特异性敲除Stat3对牙周炎小鼠焦虑抑郁样行为的影响
2
作者 周亦凝 叶之韵 +3 位作者 陈慧文 谢欣宜 周薇 宋忠臣 《上海交通大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第7期838-845,共8页
目的·观察Th17细胞特异性敲除Stat3基因对牙周炎小鼠焦虑抑郁样行为的影响。方法·通过Cre/LoxP系统繁育Th17细胞特异性敲除Stat3基因小鼠(Stat3^(fl/fl);Il17a-CreERT2,即Stat3^(△Il17a))及野生型小鼠(Stat3^(fl/fl),WT),腹... 目的·观察Th17细胞特异性敲除Stat3基因对牙周炎小鼠焦虑抑郁样行为的影响。方法·通过Cre/LoxP系统繁育Th17细胞特异性敲除Stat3基因小鼠(Stat3^(fl/fl);Il17a-CreERT2,即Stat3^(△Il17a))及野生型小鼠(Stat3^(fl/fl),WT),腹腔注射他莫昔芬诱导基因敲除,通过磁珠分选法提取小鼠CD4+T细胞并诱导其Th17细胞分化,采用反转录聚合酶链反应及蛋白免疫印迹法验证基因敲除效率。实验分为4组,分别为野生型-对照组(WT-C)、基因敲除-对照组(Stat3^(△Il17a)-C)、野生型-牙周炎组(WT-P)和基因敲除-牙周炎组(Stat3^(△Il17a)-P),其中WT-P组和Stat3^(△Il17a)-P组采用龈沟注射牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide,P.gingivalis-LPS)建立小鼠实验性牙周炎模型。4周后通过旷场实验、高架零迷宫实验和强迫游泳实验观察小鼠焦虑抑郁样行为;显微计算机断层成像观察小鼠牙槽骨吸收情况;苏木精-伊红染色观察海马神经元损伤情况,并采用酶联免疫吸附法检测小鼠脑组织中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达情况。结果·Stat3^(△Il17a)小鼠Th17细胞Stat3基因与蛋白表达均较WT小鼠显著下降(均P<0.05)。WT-P组和Stat3^(△Il17a)-P组成功建立小鼠实验性牙周炎模型,且Stat3^(△Il17a)-P组小鼠牙槽骨破坏程度较WT-P组轻。WT-P组小鼠与WT-C组小鼠比较,在旷场实验中进入中心区时间减少,在高架零迷宫实验中进入开放区时间减少,在强迫游泳实验中不动时间增加(均P<0.05),同时伴海马神经元损伤及BDNF表达水平显著下降(P<0.05)。Stat3^(△Il17a)-P组小鼠中异常行为学表现及海马神经元损伤程度,与WT-P组比较均有所减轻(均P<0.05),且Stat3^(△Il17a)-P组海马组织BDNF表达水平较WT-P组显著增加(P<0.05)。结论·牙周炎可导致小鼠产生焦虑抑郁样行为及神经元损伤,而Th17细胞特异性敲除Stat3基因可以显著减轻小鼠焦虑抑郁样行为和神经元病理改变;Stat3介导的Th17细胞免疫反应可能在牙周炎与焦虑、抑郁症状的关系中发挥重要的作用。 展开更多
关键词 牙周炎 焦虑抑郁样行为 Th17细胞 STAT3基因 条件性基因敲除 神经元损伤
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牙龈素提取物对小鼠脑神经炎症的影响 被引量：2
3
作者 张桓瑜 江旖婷 +3 位作者 朱晓晨 何智妍 周薇 宋忠臣 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期570-577,共8页
目的·观察牙龈素提取物对小鼠脑神经炎症的影响。方法·采用超声破膜结合低温超速离心,并通过超滤浓缩的方法从牙龈卟啉单胞菌ATCC33277获得牙龈素提取物。对牙龈素提取物进行蛋白定量后行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,经湿转法转移... 目的·观察牙龈素提取物对小鼠脑神经炎症的影响。方法·采用超声破膜结合低温超速离心,并通过超滤浓缩的方法从牙龈卟啉单胞菌ATCC33277获得牙龈素提取物。对牙龈素提取物进行蛋白定量后行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,经湿转法转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,封闭后分别使用赖氨酸特异性牙龈素(lysine-gingipain,Kgp)抗体和精氨酸特异性牙龈素(arginine-gingipain,Rgp)抗体对样本进行孵育,以检测提取物中的牙龈素免疫原性。通过向C57BL/6N小鼠腹腔注射牙龈素提取物建立小鼠牙龈素急性感染模型。在小鼠腹腔注射牙龈素提取物后的不同时间点,分别采用针对Kgp和Rgp的特异性荧光底物Z-His-Glu-Lys-MCA和Boc-Phe-Ser-Arg-MCA检测小鼠血浆中2种牙龈素的活性。将40只C57BL/6N小鼠随机分为4组,分别为对照组、牙龈素组、牙龈素+Kgp抑制剂(COR388)组和COR388组。预先给予COR388处理1 h后,再腹腔注射牙龈素提取物,24 h后麻醉下取材,脑组织经固定、脱水、包埋、切片等步骤后,分别使用离子钙适配分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)抗体和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体标记小鼠大脑皮层小胶质细胞和星形胶质细胞,采用免疫组织化学技术观察上述4组小鼠大脑皮层小胶质细胞及星形胶质细胞的激活情况。采用酶联免疫吸附测定检测大脑皮层肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达水平。结果·蛋白质印迹分析显示,该牙龈素提取物在截留分子量50000和70000附近有较清晰的条带,表明该提取物具有牙龈素免疫原性。此牙龈素提取物具有生物活性,腹腔注射牙龈素提取物后,小鼠血浆牙龈素活性呈现先升后降的趋势。腹腔注射牙龈素提取物后4~8 h,小鼠血浆牙龈素活性达到峰值,随后逐渐下降。免疫组织化学结果显示,小鼠大脑皮层的小胶质细胞和星形胶质细胞体积增大,且具有不规则突起,提示腹腔注射牙龈素提取物可激活小鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞。酶联免疫吸附测定结果表明小鼠大脑皮层炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平升高。结论·急性感染牙龈素提取物可促进小鼠脑神经炎症。 展开更多
关键词 牙龈卟啉单胞菌 精氨酸特异性牙龈素 赖氨酸特异性牙龈素 神经炎症 炎症因子
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小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠的构建及鉴定
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作者 朱晓晨 谢欣宜 +3 位作者 赵旭日 徐丽娜 何智妍 周薇 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期689-698,共10页
目的·基于Cre-Loxp系统构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠并验证其敲除效率。方法·将Cx3cr1^(creERT2)与Stat3^(fl/fl)基因型小鼠多代交配繁育,直到获得足够数量的Stat3^(fl/fl);Cx3cr1^(creERT2)基因型小鼠,即条件敲除... 目的·基于Cre-Loxp系统构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠并验证其敲除效率。方法·将Cx3cr1^(creERT2)与Stat3^(fl/fl)基因型小鼠多代交配繁育,直到获得足够数量的Stat3^(fl/fl);Cx3cr1^(creERT2)基因型小鼠,即条件敲除小鼠(conditional knockout,CKO);同窝Stat3^(fl/fl)基因型小鼠,即对照小鼠(wild type,WT)。利用小鼠组织提取DNA后通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),结合特异性引物分别扩增的结果来判断小鼠基因型。在CKO及WT小鼠6周龄时通过腹腔注射他莫昔芬诱导小胶质细胞中Stat3基因的敲除;2周后,随机选取CKO小鼠(n=4)及WT小鼠(n=4),利用磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分选出小胶质细胞后通过实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)技术从基因水平检测基因敲除效率;通过脑组织切片免疫荧光染色标记小胶质细胞和STAT3蛋白观察小胶质细胞中STAT3的表达情况;利用流式细胞术分别检测STAT3在小胶质细胞及脾巨噬细胞中的变化。通过尼氏染色检测神经元细胞的情况;通过脑组织切片荧光染色标记小胶质细胞,观察皮层和海马区域小胶质细胞的情况;通过流式细胞术检测小胶质细胞表型。结果·成功繁育出CKO小鼠和WT小鼠。MACS后脑细胞中小胶质细胞的占比从10%提升到85%。RT-PCR结果显示,相对于WT小鼠,CKO小鼠小胶质细胞中Stat3的mRNA相对表达量为0.3317±0.0414,mRNA水平下调(P=0.001)。脑组织免疫荧光染色结果显示,CKO小鼠小胶质细胞中STAT3蛋白的荧光强度较WT小鼠弱。脑组织流式细胞术显示:WT小鼠小胶质细胞中STAT3的阳性细胞占比为(85.30±5.69)%;CKO小鼠小胶质细胞中STAT3的阳性细胞占比为(39.70±3.88)%,STAT3表达率下降(P=0.001)。脾组织流式细胞术显示,CKO小鼠与WT小鼠脾巨噬细胞中STAT3的阳性细胞占比的差异无统计学意义(P>0.05)。尼氏染色显示,CKO小鼠与WT小鼠神经元细胞无显著差异。脑组织切片荧光染色结果显示,CKO小鼠与WT小鼠的小胶质细胞在形态上无明显差异。小胶质细胞流式细胞术显示CKO小鼠与WT小鼠小胶质细胞表型无显著差别。结论·成功构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠,为后续相关研究提供动物模型。 展开更多
关键词 小胶质细胞 信号转导和转录激活因子3(STAT3) 他莫昔芬 小鼠 CRE重组酶
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牙周炎加重主动脉弓缩窄诱导的小鼠心肌肥厚 被引量：1
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作者 李露 李雨霖 +1 位作者 柳燕 段胜仲 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期1275-1287,共13页
目的·研究牙周炎(periodontitis,PD)对主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)诱导的小鼠心肌肥厚的作用和机制。方法·将25只C57BL/6J小鼠随机分为假手术(Sham)组、TAC组及TAC+PD组。用丝线结扎加涂抹龈下菌斑的... 目的·研究牙周炎(periodontitis,PD)对主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)诱导的小鼠心肌肥厚的作用和机制。方法·将25只C57BL/6J小鼠随机分为假手术(Sham)组、TAC组及TAC+PD组。用丝线结扎加涂抹龈下菌斑的方法诱导PD模型,并在PD模型建立后做TAC手术。在假手术或TAC手术后4周,用心脏超声评估心脏功能,然后处死小鼠并取材,其样本用于实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、免疫组织化学检测、免疫荧光检测、16S rRNA基因测序。结果·TAC+PD组小鼠的牙槽骨吸收和牙龈组织炎症相关基因的表达均高于Sham组和TAC组,表明在TAC小鼠中成功建立了PD模型。与TAC组相比,TAC+PD组小鼠的左心室射血分数(EF)、左心室缩短分数(FS)值都显著降低,表明PD加重TAC导致的心功能受损。与TAC组相比,TAC+PD组小鼠的心脏质量/体质量比率(HW/BW)和心脏质量/胫骨长度比率(HW/TL)升高、肺质量/体质量比率(LW/BW)升高、心肌细胞横截面积增大、心肌肥厚相关的基因表达水平也显著升高,表明PD加重TAC诱导的心肌肥厚和心力衰竭。与TAC组相比,TAC+PD组小鼠的心肌纤维化程度上升、纤维化相关基因上调、脾脏胫骨长度比率(SW/TL)上升、炎症相关基因上调,表明PD加重了TAC诱导心肌细胞的纤维化和炎症反应。16S rRNA基因测序结果表明,TAC+PD组小鼠的口腔结扎丝线中链球菌属(Streptococcus)和韦荣球菌属(Veillonella)的相对丰度显著高于TAC组;TAC+PD组小鼠的心脏中罗尔斯通菌属(Ralstonia)和嗜糖假单胞菌属(Pelomonas)的相对丰度显著高于TAC组;而且TAC+PD组小鼠的心脏中罗尔斯通菌属和嗜糖假单胞菌属的相对丰度显著高于其口腔结扎丝线。结论·PD能够加重TAC术后小鼠心脏功能损害、心肌肥厚和心肌纤维化,并在一定程度上加重心脏的炎症反应,其作用机制可能与罗尔斯通菌属、嗜糖假单胞菌属等口腔微生物相关。 展开更多
关键词 牙周炎 主动脉弓缩窄术 心肌肥厚 口腔微生物
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