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消除小鼠肝脏冰冻切片自发荧光4种封闭方法的比较 被引量：2
1
作者 刘晓宁 邹嫣琼 +3 位作者 袁继行 李贵苹 杭勤 黄莹 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期871-875,共5页
目的通过对小鼠肝脏冰冻切片进行不同的封闭处理,探寻消除小鼠肝脏自发荧光的最佳方法,以降低对免疫荧光阳性信号的干扰,提高免疫荧光结果的准确性。方法(1)经脾静脉注射肝脏荷瘤裸小鼠:将Hepa1-6-GFP细胞通过脾脏注射方法使其在雄性无... 目的通过对小鼠肝脏冰冻切片进行不同的封闭处理,探寻消除小鼠肝脏自发荧光的最佳方法,以降低对免疫荧光阳性信号的干扰,提高免疫荧光结果的准确性。方法(1)经脾静脉注射肝脏荷瘤裸小鼠:将Hepa1-6-GFP细胞通过脾脏注射方法使其在雄性无胸腺BALB/c裸小鼠肝脏定植,并将肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行AB液(内源性生物素封闭液)、blocking、AB液+blocking、丙酮+AB液+blocking封闭处理,然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。(2)C57BL/6小鼠:对C57BL/6小鼠肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行上述4种封闭处理,用F4/80标记肝巨噬细胞(Kupffer细胞),然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。结果肝脏组织冰冻切片免疫荧光染色时,4种封闭处理都可以减弱肝脏切片的自发荧光,但丙酮+AB液+blocking封闭处理效果最佳。结论丙酮+AB液+blocking联合应用对小鼠肝脏组织冰冻切片自发荧光的消除效果最好。 展开更多
关键词 小鼠 肝 冰冻切片 自发荧光 免疫荧光技术
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色谱与质谱参数的优化对免疫抑制剂定量灵敏度的影响 被引量：2
2
作者 孟爽 周立 +2 位作者 付勤 夏立 孟丽媛 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期1461-1469,共9页
目的·考察色谱条件中的流动相及质谱离子源参数对环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)、他克莫司(tacrolimus,TaC)、西罗莫司(sirolimus,SiR)及依维莫司(everolimus,EvE)4种常见免疫抑制剂药物的液相色谱-质谱分析定量结果的影响。方法&... 目的·考察色谱条件中的流动相及质谱离子源参数对环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)、他克莫司(tacrolimus,TaC)、西罗莫司(sirolimus,SiR)及依维莫司(everolimus,EvE)4种常见免疫抑制剂药物的液相色谱-质谱分析定量结果的影响。方法·基于超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技术,通过改变流动相及离子源参数,评价不同参数设置对免疫抑制剂峰形及色谱峰响应的影响;通过考察标准曲线线性及最低定量限(limit of quantitation,LOQ)检验不同离子源温度下方法的灵敏度。结果·甲醇作为有机相能提供更窄的峰宽;水相中添加甲酸铵(ammonium formate,AF)能够明显提高色谱峰响应,高浓度的AF反而能一定程度地抑制色谱峰响应,因此选择5 mmol/L的AF作为流动相改性剂。离子源温度的优化能够明显改善色谱峰峰形和定量灵敏度,250℃下方法具良好的线性(r20.99)和灵敏度(LOQ=0.05 ng/mL)。结论·建立了基于UPLC-MS/MS技术的4种免疫抑制剂同步定量分析方法,并通过优化流动相及离子源参数便捷且显著地提高了定量灵敏度。该方法中AF的添加和离子源温度是影响定量分析的关键参数,这为基于液相色谱-质谱法的其他化合物的高灵敏度定量方法开发和优化提供新的思路。 展开更多
关键词 免疫抑制剂 超高效液相色谱-串联质谱 离子源温度 定量分析
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PTEN对FoxM1可变剪接的调控及该过程在肿瘤细胞迁移中的作用
3
作者 王晓玲 葛梦凯 沈少明 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1339-1347,共9页
目的探讨10号染色体磷酸酶和张力同源蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)对叉头框转录因子M1(forkhead box M1,FoxM1)可变剪接的调控,以及该调控作用对肿瘤细胞迁移的影响。方法在人胚肾293T细胞,人前列腺癌DU145细胞,人结肠腺... 目的探讨10号染色体磷酸酶和张力同源蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)对叉头框转录因子M1(forkhead box M1,FoxM1)可变剪接的调控,以及该调控作用对肿瘤细胞迁移的影响。方法在人胚肾293T细胞,人前列腺癌DU145细胞,人结肠腺癌RKO细胞,人结肠癌SW480、SW620细胞中用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲低PTEN的mRNA水平。设计针对FoxM1及其亚型FoxM1B和FoxM1C的特异性引物,用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测FoxM1B和FoxM1C的mRNA表达水平在PTEN敲低前后的差异。在DU145细胞中分别过表达FoxM1B和FoxM1C,利用Transwell细胞迁移实验和划痕实验检测两者对肿瘤细胞迁移的影响。通过免疫荧光和双荧光素酶报告基因检测实验,探索FoxM1B和FoxM1C对肿瘤细胞迁移调控差异的潜在机制。结果①将293T、DU145、RKO、SW480和SW620细胞内的PTEN敲低后,qRT-PCR检测发现,与对照细胞相比,在PTEN敲低的细胞中FoxM1B的mRNA均显著增多,而FoxM1C的mRNA表现为减少或不变。PTEN敲低不影响FoxM1的转录水平,而影响FoxM1的可变剪接,促进了FoxM1B亚型的生成。②Transwell细胞迁移实验结果显示,与对照细胞相比,FoxM1B过表达组DU145细胞迁移数量增多(P=0.024),FoxM1C过表达组DU145细胞迁移数量减少(P=0.000)。细胞划痕实验结果显示,过表达FoxM1B的DU145细胞愈合能力显著增强(P=0.001),过表达FoxM1C的DU145细胞愈合能力减弱(P=0.021)。FoxM1B和FoxM1C对肿瘤细胞迁移具有相反的调节作用:FoxM1B促进肿瘤细胞迁移,而FoxM1C则抑制肿瘤细胞迁移。③FoxM1B和FoxM1C过表达,均未引起β连环蛋白入核。双荧光素酶报告基因检测实验发现FoxM1B和FoxM1C的转录活性没有差别,FoxM1B和FoxM1C在调控肿瘤转移方面的差异不是由β连环蛋白转位介导的。结论PTEN敲低影响肿瘤细胞内FoxM1的可变剪接,导致促迁移的FoxM1B表达增加,从而促进肿瘤细胞迁移。 展开更多
关键词 磷酸酶和张力同源蛋白 叉头框转录因子M1 可变剪接 肿瘤细胞 迁移
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