嗜肺军团菌重组MOMP蛋白间接ELISA方法的建立及其在血清学诊断中的应用 被引量：3

1

作者 王涛 张彩霞 +1 位作者 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1322-1326,共5页

目的表达及纯化出嗜肺军团菌主要外膜蛋白(MOMP)作为诊断抗原,研究其在嗜肺军团菌感染血清学诊断中的实用价值。方法将已成功构建的重组质粒pET-momp转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中,诱导重组MOMP表达,运用SDS-PAGE和亲和层析法... 目的表达及纯化出嗜肺军团菌主要外膜蛋白(MOMP)作为诊断抗原,研究其在嗜肺军团菌感染血清学诊断中的实用价值。方法将已成功构建的重组质粒pET-momp转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中,诱导重组MOMP表达,运用SDS-PAGE和亲和层析法纯化。用DRG军团菌IgG、IgM、IgA的ELISA试剂盒筛选出58份阳性血清和32份阴性血清,用纯化的MOMP蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA,同时与R&D公司军团菌的IgG、IgM、IgA ELISA试剂盒分别检测已筛选血清中的IgG、IgM、IgA抗体,然后用受试者工作特征(ROC)曲线对这2种方法进行比较,通过敏感性、特异性以及检测结果的一致性,来评价重组MOMP间接ELISA的应用价值。结果成功诱导表达并纯化出相对分子质量(M r)大约为45 000的重组MOMP蛋白。重组MOMP建立的间接ELISA分别检测筛选血清中IgG、IgM、IgA抗体与R&D公司的ELISA试剂盒进行比较,IgG抗体灵敏度90.9%,特异度91.7%,一致性Kappa值0.784(P<0.05),ROC曲线下的面积0.913;IgM抗体灵敏度91.4%,特异度90.6%,一致性Kappa值0.809(P<0.05),ROC曲线下的面积为0.910;IgA抗体灵敏度92.1%,特异度88.9%,一致性Kappa值0.793(P<0.05),ROC曲线下的面积0.905。结论成功诱导表达及纯化出重组MOMP蛋白,将其作为诊断抗原所建立的间接ELISA表现出了较好的特异性,灵敏度和一致性,为军团病的血清学诊断试剂盒的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 嗜肺军团菌 表达 重组蛋白MOMP ELISA

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共表达口蹄疫病毒VP1-2A基因与猪IL-2重组腺病毒的构建及其免疫效果研究 被引量：3

2

作者 苏春霞 段相国 +3 位作者 郑洁 林源 郭琳 陈溥言 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第2期1-5,共5页

构建共表达口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因和猪白细胞介素2(IL-2)基因的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。将FMDV VP1-2A基因和猪IL-2基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中,在受体菌中与腺病毒骨... 构建共表达口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因和猪白细胞介素2(IL-2)基因的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。将FMDV VP1-2A基因和猪IL-2基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中,在受体菌中与腺病毒骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3同源重组。重组腺病毒质粒转染HEK-293A细胞,得到重组腺病毒rAd5VP1-2A-Po IL-2。MTT法检测重组IL-2的生物活性。用rAd5VP1-2A-poIL-2免疫接种小鼠,同时设免疫单独表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5VP1和空腺病毒的对照组。通过检测淋巴细胞增殖功能,特异性抗体分泌,IL-4和IFN-γ的表达水平衡量rAd5VP1-2A-poIL-2对小鼠特异性免疫应答的影响。结果显示,成功获得了rAd5VP1-2A-poIL-2,MTT法检测重组IL-2具有生物学活性。小鼠免疫试验结果显示,与rAd5VP1免疫组相比,rAd5VP1-2ApoIL-2免疫既能增强重组病毒诱导小鼠淋巴细胞增殖的能力,又能提高重组病毒诱导小鼠特异性抗体的水平。细胞因子检测结果显示,串联IL-2能促进重组病毒诱导Th1和Th2的分化。研究结果说明,rAd5VP1-2A-poIL-2可望成为口蹄疫的候选疫苗。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 重组腺病毒 VP1-2A基因 白细胞介素2

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共表达口蹄疫病毒VP1-2A与猪IFN-α的重组腺病毒增强小鼠免疫功能 被引量：1

3

作者 苏春霞 段相国 +2 位作者 曹瑞兵 郑洁 陈溥言 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1129-1132,共4页

目的构建串联表达口蹄疫病毒VP1-2A和猪干扰素-α的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。方法将FMDV VP1-2A基因和α干扰素基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体中,得到的阳性穿梭质粒与腺病毒骨架载体在大肠杆菌BJ5183中进行... 目的构建串联表达口蹄疫病毒VP1-2A和猪干扰素-α的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。方法将FMDV VP1-2A基因和α干扰素基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体中,得到的阳性穿梭质粒与腺病毒骨架载体在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。重组腺病毒质粒感染HEK293A细胞,获得重组腺病毒rAd5VP1-2A-poIFN-α。用rAd5VP1-2ApoIFN-α免疫BALB/c小鼠,同时设注射单独表达FMDV VP1的重组腺病毒(rAd5VP1)和空腺病毒的对照组。通过ELISA检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a及细胞因子IL-4、IFN-γ的表达水平;MTT法检测淋巴细胞增殖指数。结果成功构建了共表达FMDV VP-2A和IFN-α的重组腺病毒rAd5VP1-2A-poIFN-α。小鼠免疫实验结果显示,与单独表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5VP1相比,重组腺病毒rAd5VP1-2A-poIFN-α能增强特异性IgG、IgG1和IgG2a的分泌,促进IL-4和IFN-γ的分泌,并能增强小鼠淋巴细胞增殖功能。结论重组腺病毒rAd5VP1-2A-poIFN-α能明显增强小鼠特异性免疫应答。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 重组腺病毒 VP1基因 干扰素-Α

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SLC11A1基因多态性与宁夏南部人群肺结核易感性研究 被引量：2

4

作者 朱圭娜 侯怀哲 +9 位作者 尹媛婕 陈丹丹 Ellis K. Magda 关光玉 杨书鲲 杨延辉 Donald P. McManus 景永峰 王平 杨玉荣 《中国防痨杂志》 CAS 2017年第10期1080-1087,共8页

目的 探索SLC11A1基因rs17235409、rs17235416、rs3731865等位点多态性与中国宁夏回族自治区南部人群肺结核易感性的关系.方法 于2010年7-11月选取宁夏回族自治区南部的西吉、海原、泾原、彭阳、原州、同心、中卫、隆德等8个地区,并在... 目的 探索SLC11A1基因rs17235409、rs17235416、rs3731865等位点多态性与中国宁夏回族自治区南部人群肺结核易感性的关系.方法 于2010年7-11月选取宁夏回族自治区南部的西吉、海原、泾原、彭阳、原州、同心、中卫、隆德等8个地区,并在该地区居住10年以上,且经当地疾病预防控制中心确诊为活动性肺结核的患者作为观察组,共965例.同期选取上述地区的健康人群作为对照组,共897名.收集研究对象基本信息,采集研究对象外周静脉血5 ml,应用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝,-80℃保存,用于提取基因组DNA.利用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法对SLC11A1基因rs17235409、rs17235416、rs3731865位点进行基因分型,分析3个单核苷酸多态性（SNP）位点与结核易感性的关系.结果 rs17235409位点AA、AG、GG基因型在观察组和对照组中分布频率分别为1.4％（13/950）、23.5％（223/950）、75.1％（714/950）和2.7％ （23/842）、25.1％（211/842）、72.2％（608/842）,两组比较差异无统计学意义（x2=5.12,P=0.077）;rs17235416位点TGTG（-）/（-）、TGTG（＋）/（-）、TGTG（＋）/（＋）基因型在观察组和对照组中的分布频率分别为1.8％（17/939）、22.7％（213/939）、75.5％（709/939）和3.4％（28/824）、23.8％（196/824）、72.8％（600/824）,两组比较差异无统计学意义（x2=4.99,P=0.082）;rs3731865位点CC、GC、GG基因型在观察组和对照组中分布频率分别为2.3％（22/951）、26.1％（248/951）、71.6％（681/951）和2.4％（20/843）、24.9％（210/843）、72.7％（613/843）,两组比较差异无统计学意义（x2 =0.32,P=0.852）.在隐性模型中,rs17235409位点AA、AG＋ GG-基因型在观察组和对照组中分布频率分别为1.4％（13/950）、98.6％（937/950）和2.7％（23/842）、97.3％（819/842）,两组分布频率比较差异有统计学意义（x2=4.21,P=0.040）;但多因素logistic回归分析结果与单因素结果不-致,说明条件因素包括性别、年龄、民族等不同对结果有一定影响,所以不能说明rs17235409位点与肺结核发病相关（OR=0.51,95％CI=0.25～1.03,P=0.060）.rs17235416位点TGTG（-）/（-）、TGTG（＋）/（-）＋TGTG（＋）/（＋）基因型在观察组和对照组中分布频率分别为1.8％（17/939）、98.2％（922/939）和3.4％（28/824）、96.6％（796/824）,两组分布频率比较差异有统计学意义（x2 =4.45,P=0.038,OR=0.52、1.91,95％CI=0.23～0.97、1.04～3.51）;经多因素logistic回归分析,排除性别、年龄和民族等条件因素对结果的影响,多因素结果与单因素结果相似,发现条件因素对结果无影响,结果仍有意义,说明携带rs17235416位点TGTG（＋）/（-）和（或）TGTG（＋）/（＋）基因型的个体较携带TGTG（-）/（-）基因型的个体患肺结核的风险增加（OR=0.54,95％CI：0.29～1.00,P=0.049）.结论 SLC11A1基因rs17235409和rs3731865位点多态性与宁夏南部地区人群肺结核易感性不相关.而rs17235416位点在隐性模型中,即携带TGTG（＋）/（-）与TGTG（＋）/（＋）基因型的个体发病风险增高. 展开更多

关键词 结核 肺 多态性 单核苷酸 疾病易感性 病例对照研究

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重组白介素-2增强口蹄疫病毒多表位疫苗免疫效果研究 被引量：1

5

作者 苏春霞 段相国 陈溥言 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第12期1-4,共4页

通过研究重组白细胞介素-2(IL-2)对口蹄疫病毒(FMDV)多表位疫苗免疫效果的增强作用,为IL-2作为FMDV表位疫苗佐剂应用提供实验依据。6周龄雌性Balb/c小鼠,分为4组,第1组联合免疫表达猪IL-2的重组腺病毒(rAd5poIL-2)和串联表达FMDV多表位... 通过研究重组白细胞介素-2(IL-2)对口蹄疫病毒(FMDV)多表位疫苗免疫效果的增强作用,为IL-2作为FMDV表位疫苗佐剂应用提供实验依据。6周龄雌性Balb/c小鼠,分为4组,第1组联合免疫表达猪IL-2的重组腺病毒(rAd5poIL-2)和串联表达FMDV多表位基因的重组腺病毒(rAd5EGS),第2、3和4组分别注射rAd5EGS、灭活疫苗和PBS,间隔2周免疫1次,共免疫3次。首免后每周采血分离小鼠血清,通过ELISA检测血清中特异性IgG;首免后6周检测血清中抗体亚型IgG1、IgG2a及细胞因子IL-4和IFN-γ的表达水平,同时分离脾细胞,MTT法检测淋巴细胞增殖指数。结果显示,联合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS既能增强rAd5EGS诱导小鼠特异性IgG、IgG1和IgG2a的分泌,又能增强其诱导淋巴细胞增殖能力,且免疫效果强于灭活疫苗;细胞因子检测结果显示,联合免疫rAd5poIL-2后能增强rAd5EGS诱导小鼠IL-4和IFN-γ的分泌,且其诱导IL-4和IFN-γ分泌能力也强于灭活疫苗。说明重组IL-2能有效增强FMDV多表位疫苗诱导抗体分泌能力和细胞免疫应答,rAd5poIL-2有望作为FMDV表位疫苗的候选佐剂。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 多表位疫苗 佐剂 白细胞介素-2

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嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强蛋白的表达和纯化及其在血清学诊断中的应用 被引量：3

6

作者 刘黎 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期577-580,共4页

目的表达和纯化出嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强(MIP)蛋白,研究其在军团菌肺炎血清学诊断中应用价值。方法将已构建成功的重组质粒pET-mip转化E.coli BL21感受态细胞,诱导MIP蛋白表达,运用SDS-PAGE分析和亲和层析法纯化。用DRG军团菌IgG/I... 目的表达和纯化出嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强(MIP)蛋白,研究其在军团菌肺炎血清学诊断中应用价值。方法将已构建成功的重组质粒pET-mip转化E.coli BL21感受态细胞,诱导MIP蛋白表达,运用SDS-PAGE分析和亲和层析法纯化。用DRG军团菌IgG/IgM/IgA的ELISA检测试剂盒筛出40份阳性血清和30份阴性血清,用纯化的MIP蛋白建立间接ELISA,同时与R&D的ELISA IgG、IgM、IgA试剂盒分别检测已筛选血清中的IgG、IgM、IgA抗体,然后对这两种方法进行比较,通过敏感性、特异性以及不同检测结果的一致性,来评价该方法的应用价值。结果诱导相对分子质量(Mr)大约40 000的MIP融合蛋白在E.coli BL21中表达并纯化。纯化蛋白建立的间接ELISA分别检测筛选血清中IgG、IgM、IgA抗体与国外ELISA试剂盒(R&D)进行比较,IgG抗体的灵敏度88.5%,特异度95.5%,一致性Kappa值0.846(P<0.05),ROC曲线下面积0.927。IgM抗体的灵敏度89.3%,特异度97.6%,一致性Kappa值0.88(P<0.05),ROC曲线下面积0.947。IgA抗体的灵敏度90%,特异度95.2%,一致性Kappa值0.856(P<0.05),ROC曲线下面积0.931。结论成功诱导了嗜肺军团菌MIP蛋白稳定表达并纯化,运用MIP作为包被抗原的军团菌肺炎的血清学诊断方法具有较高的诊断价值。 展开更多

关键词 嗜肺军团菌 巨噬细胞感染增强蛋白 蛋白表达 血清学诊断

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槐定碱抑制内毒素血症小鼠肺组织LPS模式识别受体的表达 被引量：9

7

作者 梁锦屏 谢建宁 +1 位作者 王大军 周娅 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1087-1091,1095,共6页

目的:探讨槐定碱对内毒素血症小鼠肺组织LPS识别受体LBP、CD14、TLR4及下游炎症介质TNF-α的影响及意义。方法:BALB/c小鼠尾静脉注射LPS制备内毒素血症小鼠模型,注射LPS后30分钟给予槐定碱高(12 mg/kg)、中(6mg/kg)、低(3 mg/kg)三个剂... 目的:探讨槐定碱对内毒素血症小鼠肺组织LPS识别受体LBP、CD14、TLR4及下游炎症介质TNF-α的影响及意义。方法:BALB/c小鼠尾静脉注射LPS制备内毒素血症小鼠模型,注射LPS后30分钟给予槐定碱高(12 mg/kg)、中(6mg/kg)、低(3 mg/kg)三个剂量干预,并分别在2、6、12、24小时各时间点取血液和肺组织,肉眼及光镜观察肺组织的病理变化;以肺湿/干重(W/D)比检测肺水含量;用RT-PCR检测肺组织中LBP、CD14、TLR4的mRNA表达;Western blot检测肺组织TLR4蛋白的表达;放免法检测血清TNF-α含量。结果:与内毒素血症模型组小鼠肺组织比较,槐定碱三个剂量干预组均不同程度减轻内毒素血症小鼠肺组织病理损伤,降低肺组织W/D值,并且显著下调同时间点模型小鼠肺组织LBP、CD14、TLR4的mRNA表达及TLR4蛋白的表达;槐定碱高、中剂量干预可显著抑制模型小鼠血清TNF-α水平(P<0.01或P<0.05)。结论:槐定碱对内毒素血症小鼠肺组织的保护作用机制可能与下调LPS识别受体LBP、CD14、TLR4表达,抑制下游炎症因子TNF-α的释放有关。 展开更多

关键词 槐定碱 内毒素 LBP CD14 TLR4 TNF-α

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黄芩苷经TLR2/NF-κB途径减轻类风湿关节炎大鼠滑膜炎 被引量：36

8

作者 白琳 杨雨欣 +2 位作者 万巧凤 黄菱 段海政 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期1569-1573,共5页

目的评价不同剂量黄芩苷对SD大鼠类风湿关节炎的疗效,并探讨其可能的作用机制。方法制备SD大鼠类风湿关节炎模型,测量后足的肿胀度;通过不同剂量黄芩苷溶液灌胃治疗后,观察膝关节滑膜HE染色切片病理变化;实时荧光定量PCR测定膝关节滑膜... 目的评价不同剂量黄芩苷对SD大鼠类风湿关节炎的疗效,并探讨其可能的作用机制。方法制备SD大鼠类风湿关节炎模型,测量后足的肿胀度;通过不同剂量黄芩苷溶液灌胃治疗后,观察膝关节滑膜HE染色切片病理变化;实时荧光定量PCR测定膝关节滑膜组织TLR2及MyD88mRNA表达;Westernblot测定滑膜组织TLR2、MyD88及NF-κBp65蛋白表达。结果黄芩苷30、60mg·kg^(-1)均能明显减弱滑膜组织中成纤维细胞的增殖及炎性损伤程度,明显降低滑膜组织TLR2及MyD88mRNA表达(P<0.01),明显减弱TLR2、MyD88及NF-κBp65蛋白表达(P<0.05)。结论黄芩苷具有良好的抗类风湿关节滑膜炎作用,其可能是通过抑制TLR2-NF-κB信号通路的活化来实现的。 展开更多

关键词 黄芩苷 类风湿关节炎 TLR2 MyD88 NF-ΚB p65 HE染色 类风湿关节炎滑膜成纤维细胞

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上调巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能 被引量：4

9

作者 郑修军 王琦 +1 位作者 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1022-1026,共5页

目的构建大鼠FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,观察其对巨噬细胞的作用。方法以大鼠肝脏mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒四环素(Tet)顺式应答元件(TRE),构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表... 目的构建大鼠FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,观察其对巨噬细胞的作用。方法以大鼠肝脏mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒四环素(Tet)顺式应答元件(TRE),构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒调节质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和调节病毒,测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和调节病毒共感染巨噬细胞,经梯度浓度强力霉素(DOX)诱导,免疫荧光技术检测巨噬细胞FcγRⅡB表达,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。经不同浓度DOX诱导后的腹腔巨噬细胞分别检测吞噬和趋化功能。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。表达和调节病毒滴度均达到106转导单位/m L。巨噬细胞被病毒感染后经DOX诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示,FcγRⅡB能够在巨噬细胞表达;实时荧光定量PCR和Western blot结果显示FcγRⅡB表达水平与DOX浓度呈正相关。巨噬细胞的吞噬和趋化功能与FcγRⅡB表达呈负相关。结论调节巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能。 展开更多

关键词 FcγRⅡB 慢病毒诱导表达载体 抑制性受体 巨噬细胞 吞噬和趋化

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滤泡调节性T细胞减少与类风湿性关节炎发生和发展相关 被引量：7

10

作者 王佩佩 池淑红 +2 位作者 王雪梅 崔振华 张艳丽 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期152-157,共6页

目的探讨滤泡调节性T(Tfr)细胞在类风湿性关节炎(RA)发病中的可能机制。方法采用流式细胞术检测20例RA患者及20例健康体检者外周血中CD4^(+)CXCR5^(+)FOXP3^(+)ICOS^(+)Tfr细胞的百分比并分析Tfr细胞比例与RA临床实验室检测指标的相关性... 目的探讨滤泡调节性T(Tfr)细胞在类风湿性关节炎(RA)发病中的可能机制。方法采用流式细胞术检测20例RA患者及20例健康体检者外周血中CD4^(+)CXCR5^(+)FOXP3^(+)ICOS^(+)Tfr细胞的百分比并分析Tfr细胞比例与RA临床实验室检测指标的相关性;ELISA检测患者血清中白细胞介素10(IL-10)、IL-12、IL-2、转化生长因子β(TGF-β)、CXC趋化因子配体13(CXCL13)的水平;实时定量PCR检测外周血单个核细胞(PBMC)的B细胞淋巴瘤因子6(Bcl6)、B淋巴细胞诱导成熟蛋白1(Blimp-1)的mRNA表达;免疫组织化学法检测RA患者关节滑膜Bcl6、CXCL13的表达。结果与健康对照组相比,RA患者外周血Tfr细胞比例显著下降;Tfr细胞百分比与C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、血沉(ESR)、28关节疾病活动度评分(DAS28)水平呈负相关;RA患者血清中IL-12、CXCL13表达水平显著升高,IL-2、IL-10、TGF-β表达水平显著降低;RA患者PBMC的Bcl6 mRNA水平显著增高,而Blimp-1 mRNA的表达显著降低;RA患者的关节滑膜中观察到Bcl6、CXCL13显著高表达。结论外周血Tfr细胞比例减少可能与RA的发生发展有关。 展开更多

关键词 类风湿性关节炎(RA) 滤泡调节性T(Tfr)细胞 白细胞介素 趋化因子

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人可溶型FcγRIIb的制备及其功能初步研究 被引量：3

11

作者 张雷 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期952-955,共4页

目的:检测正常人和SLE患者血清中可溶型FcγRIIb(husFcγRIIb)含量,诱导表达并纯化人可溶性FcγRIIb,检测其与血清中免疫复合物结合力及对B细胞抗体分泌功能的影响。方法:ELISA法检测人血清中可溶型FcγRIIb含量,IPTG诱导含有pET-sFcγR... 目的:检测正常人和SLE患者血清中可溶型FcγRIIb(husFcγRIIb)含量,诱导表达并纯化人可溶性FcγRIIb,检测其与血清中免疫复合物结合力及对B细胞抗体分泌功能的影响。方法:ELISA法检测人血清中可溶型FcγRIIb含量,IPTG诱导含有pET-sFcγRIIb的大肠杆菌BL21,镍琼脂糖磁珠纯化目的蛋白,可溶型FcγRIIb包被ELISA板,ELISA方法检测其与血清中免疫复合物结合能力,免疫磁珠法分选B细胞,分组刺激培养,ELISA检测培养物上清中IgM含量。结果:SLE患者血清中可溶型FcγRIIb浓度低于正常人(P<0.05);诱导表达并纯化获得相对分子质量(Mr)为41 500的重组蛋白;重组可溶型FcγRIIb可以与血清中免疫复合物结合,二者孵育后吸光度(A)值随血清中免疫复合物浓度逐渐增高,至受体结合度饱和时达最大;不同刺激条件下B细胞培养10 d,各实验组抗体浓度均高于细胞对照组(P<0.01),SPA组、SPA+husFcγRIIb组抗体浓度无显著差异(P﹥0.05),SPA+IgG型抗人IgM组抗体滴度明显高于SPA组(P<0.01),SPA+husFcγRIIb+IgG型抗人IgM组抗体滴度明显低于SPA+IgG型抗人IgM组(P<0.01)、SPA组(P<0.01)和SPA+husFcγRIIb组(P<0.01)。结论:SLE患者血清中可溶性FcγRIIb含量低于正常人,重组人可溶性FcγRIIb可以与血清中免疫复合物结合,抑制免疫复合物对B淋巴细胞的激活,减少IgM型抗体的分泌。 展开更多

关键词 FCΓRIIB 可溶性 结合力 抗体分泌

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变应性鼻炎IgE高亲和力可溶型Fc段受体1α(sFcε1α)蛋白的制备及血清中相应抗体的检测 被引量：2

12

作者 邢慧慧 邵辉 +1 位作者 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期650-654,共5页

目的构建人可溶型Fc段受体1α(s FcεR1α)的原核表达载体,诱导表达并纯化重组FcεR1α胞外区段蛋白,检测其与血清中Ig E的结合力及相应抗体的含量。方法应用巢式PCR技术获得人FcεR1α胞外区段基因,构建原核表达载体p ETs Fcε1α,最... 目的构建人可溶型Fc段受体1α(s FcεR1α)的原核表达载体,诱导表达并纯化重组FcεR1α胞外区段蛋白,检测其与血清中Ig E的结合力及相应抗体的含量。方法应用巢式PCR技术获得人FcεR1α胞外区段基因,构建原核表达载体p ETs Fcε1α,最佳诱导条件表达出s FcεR1α,采用亚胺二乙酸His标签纯化树脂纯化并进行Western blot法鉴定。ELISA检测人s FcεR1α与血清中Ig E的结合力及血清中s FcεR1α总量、s FcεR1α-Ig E及抗FcεR1α自身抗体的含量。结果扩增出人FcεR1α胞外区段基因,大小为600 bp左右。p ET-s FcεR1α经PCR、双酶切、测序鉴定正确。诱导表达、纯化出人s FcεR1α,相对分子质量(Mr)大小约为42 000。Western blot法鉴定为人s FcεR1α。人s FcεR1α可以与人血清中Ig E结合。变应性鼻炎(AR)患者血清中s FcεR1α总量、s FcεR1α-Ig E含量均低于正常人,抗FcεR1α抗体含量高于正常人。结论获得人s FcεR1α,s FcεR1α与人血清中Ig E有较强的结合力,AR患者血清中s FcεR1α总量、s FcεR1α-Ig E含量均低于正常人,抗FcεR1α抗体含量高于正常人。 展开更多

关键词 IG E高亲和力Fc段受体1α(FcεR1α) 可溶型 结合力 自身抗体

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氧化苦参碱调节CIA小鼠滤泡辅助性T细胞的研究 被引量：5

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作者 曹干 王宁萍 +3 位作者 崔振华 王佩佩 杨勇娅 张艳丽(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第19期2371-2374,共4页

目的:探讨氧化苦参碱(OMT)对胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠滤泡辅助性T(Tfh)细胞比例和功能的影响。方法:构建牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂诱导的DBA/1J CIA小鼠模型,于首次免疫后第15天腹腔注射不同剂量的OMT,持续30 d。监测CIA小鼠的关节肿... 目的:探讨氧化苦参碱(OMT)对胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠滤泡辅助性T(Tfh)细胞比例和功能的影响。方法:构建牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂诱导的DBA/1J CIA小鼠模型,于首次免疫后第15天腹腔注射不同剂量的OMT,持续30 d。监测CIA小鼠的关节肿胀程度及关节炎评分;HE染色观察小鼠踝关节组织病理变化;提取脾细胞用流式细胞术检测Tfh细胞比例;采集小鼠眼球血,ELISA法测定小鼠血清Ⅱ型胶原抗体(CⅡ-Ab)和IL-21含量。结果:OMT可明显缓解CIA小鼠足爪肿胀,降低关节炎指数,减轻关节滑膜增生和炎症细胞浸润,降低脾Tfh细胞比例,抑制血清IL-21和CⅡ-Ab表达。结论:OMT可能通过调节Tfh细胞缓解RA。 展开更多

关键词 CIA 氧化苦参碱 类风湿关节炎 TFH

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嗜肺军团菌MOMP通过激活NOD2/RIP2信号通路抑制RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能并增强其趋化能力 被引量：4

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作者 甄庆洁 曹秀琴 +1 位作者 卢敬敬 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期488-494,共7页

目的探讨嗜肺军团菌主要外膜蛋白(MOMP)对RAW264. 7巨噬细胞吞噬功能和趋化功能的影响并探讨其机制。方法采用MOMP与RAW264. 7巨噬细胞进行体外共培养,用CCK-8法检测MOMP对RAW264. 7巨噬细胞的毒性,确定半数抑制浓度(IC50)。采用(1. 14... 目的探讨嗜肺军团菌主要外膜蛋白(MOMP)对RAW264. 7巨噬细胞吞噬功能和趋化功能的影响并探讨其机制。方法采用MOMP与RAW264. 7巨噬细胞进行体外共培养,用CCK-8法检测MOMP对RAW264. 7巨噬细胞的毒性,确定半数抑制浓度(IC50)。采用(1. 14、0. 57、0. 28)μg/m L MOMP分别处理RAW264. 7巨噬细胞,并设细胞对照组。RAW264. 7巨噬细胞处理24、48、72 h,收集细胞和培养上清,用中性红吞噬实验检测巨噬细胞的吞噬功能;用TranswellTM小室检测巨噬细胞的趋化功能; ELISA检测细胞培养上清单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白细胞介素10(IL-10)的含量;实时定量PCR检测巨噬细胞核苷酸结合寡聚结构域1(NOD1)、NOD2、受体相互作用蛋白2(RIP2) mRNA水平,Western blot法检测NOD1、NOD2、RIP2的蛋白水平。结果 CCK-8法检测MOMP对RAW264. 7巨噬细胞的IC_(50)为5. 69μg/m L;与对照细胞相比,MOMP处理引起RAW264. 7巨噬细胞吞噬功能降低且呈剂量和时间依赖性;随着MOMP剂量的增加,巨噬细胞的趋化能力及细胞培养上清中MCP-1、IL-10的分泌水平增加,并在36 h达到峰值; NOD2、RIP2的mRNA和蛋白表达水平也增加,NOD2和RIP2的mRNA水平在12 h达到高峰,蛋白水平在24 h达到峰值。结论 MOMP抑制RAW264. 7巨噬细胞的吞噬功能并增强其趋化功能,与激活NOD2/RIP2信号通路有关。 展开更多

关键词 嗜肺军团菌 主要外膜蛋白(MOMP) 巨噬细胞 吞噬功能 趋化功能 NOD样受体(NLR)

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氧化苦参碱经Bcl-6/CXCR5信号调控CIA小鼠Tfh-B细胞的实验研究 被引量：4

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作者 崔振华 王佩佩 +2 位作者 詹静慧 摆茹 张艳丽 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第19期2351-2356,共6页

目的:初步探讨氧化苦参碱(OMT)通过Bcl-6/CXCR5信号通路调控胶原诱导关节炎(CIA)小鼠Tfh-B细胞的免疫学机制。方法:28只雄性DBA/1J小鼠随机分为正常对照组、CIA模型组、地塞米松(DXMS)组、OMT组,每组各7只。构建CIA模型并按分组方案给... 目的:初步探讨氧化苦参碱(OMT)通过Bcl-6/CXCR5信号通路调控胶原诱导关节炎(CIA)小鼠Tfh-B细胞的免疫学机制。方法:28只雄性DBA/1J小鼠随机分为正常对照组、CIA模型组、地塞米松(DXMS)组、OMT组,每组各7只。构建CIA模型并按分组方案给予药物腹腔注射,正常对照组注射等量生理盐水,1次/d,直至第45天结束模型。测量关节肿胀度和关节炎评分,采用ELISA方法测定小鼠血清CII-Ab、IL-21、IL-10及TGF-β水平;HE染色观察小鼠关节病理变化,IHC方法检测其关节滑膜组织Bcl-6及CXCR5的表达;测定脾指数;流式细胞术检测脾Tfh、B细胞的比例;RT-qPCR测定脾单个核细胞Bcl-6、Blimp-1 mRNA的转录水平。结果:OMT可明显缓解减轻CIA小鼠关节炎症,改善关节滑膜增生及软骨破坏,减少炎症细胞浸润;上调关节滑膜组织Bcl-6、CXCR5的表达。下调CIA小鼠血清CII-Ab、IL-21的表达水平而上调IL-10、TGF-β水平;降低脾指数,减少脾Tfh及B细胞的比例,下调脾单个核细胞Bcl-6 mRNA的表达而上调Blimp-1 mRNA的表达。结论:OMT可能经Bcl-6/CXCR5信号通路调控Tfh-B细胞反应从而减缓类风湿性关节炎(RA)的发生与进展。 展开更多

关键词 氧化苦参碱 BCL-6 CXCR5 BLIMP-1

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嗜肺军团菌激活Nrf2-Keap1通路抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞自噬 被引量：4

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作者 盛琳琳 曹秀琴 +2 位作者 甄庆洁 杨晓辰 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期878-885,共8页

目的观察嗜肺军团菌(LP)对RAW264.7巨噬细胞自噬流及其自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制.方法活的LP和灭活的LP[感染复数(MOI)=10,50,100]分别处理RAW264.7巨噬细胞1、2、3h,通过筛选得出MOI=50,处理2h为其最佳作用条件.用... 目的观察嗜肺军团菌(LP)对RAW264.7巨噬细胞自噬流及其自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制.方法活的LP和灭活的LP[感染复数(MOI)=10,50,100]分别处理RAW264.7巨噬细胞1、2、3h,通过筛选得出MOI=50,处理2h为其最佳作用条件.用雷帕霉素(RAPA)处理RAW264.7巨噬细胞12 h后,再加入活的和灭活的LP共培养2 h,并设正常对照组、RAPA处理组、活LP组、RAPA处理的活LP组、灭活LP组和RAPA处理的灭活LP组.用携带双荧光标记蛋白基因和微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)基因的真核过表达质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B转染巨噬细胞,监测巨噬细胞自噬流的变化;用基因芯片在处理的最佳时间点筛选出LP影响巨噬细胞自噬的相关因子溶酶体/内体膜跨膜蛋白封闭蛋白(CLN3)、组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、G蛋白信号传导调节蛋白19(RGSI9)、肿瘤坏死因子(TNF)、组织蛋白酶B(CTSB)、GABAA型受体相关蛋白类似物2(GABARAP12)、P62、微管相关蛋白1轻链3(LC3);实时荧光定量PCR验证基因芯片结果并检测相关信号通路因子核因子E2相关因子2(Nrf2)、beclin1和Kelch样环氧氯丙烧相关蛋白1(Keapl)的mRNA水平;Western blot法验证基因芯片结果并检测Nrf2、beclinl和Keapl的蛋白水平.结果与对照组相比,活LP组和灭活LP组的自噬流受到抑制;与RAPA处理组相比,活LP组和灭活LP组自噬流受到抑制.基因芯片检测显示活LP组和灭活LP组LC3的表达下调,Pb2的表达上调.实时定量PCR、Western blot验证结果与基因芯片一致.Keap1、beclin1的mRNA和蛋白水平明显下降,Nrf2 mRNA和蛋白的水平明显增加.结论LP可抑制巨噬细胞自噬,可能与激活Nrf2-Keapl信号通路有关. 展开更多

关键词 嗜肺军团菌(LP) 巨噬细胞 自噬 抑制作用

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含人FcγRⅡB基因慢病毒的制备及其在HT-1080细胞中的表达 被引量：2

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作者 刘慧宇 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期561-564,568,共5页

目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导... 目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和可诱导病毒,分别测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和可诱导病毒共感染HT-1080细胞,经梯度浓度强力霉素(Dox)诱导,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,免疫荧光染色检测HT-1080细胞FcγRⅡB表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定,测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100%。表达病毒滴度达106TU/mL,可诱导病毒滴度达105TU/mL,感染性良好。HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞中表达;实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关。结论成功制备了FcγRⅡB慢病毒,感染HT-1080细胞后可实现FcγRⅡB的诱导表达。 展开更多

关键词 FcγRⅡB 慢病毒诱导表达载体 调控表达

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重组嗜肺军团菌鞭毛蛋白A(rflaA)体外诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6和IL-1β 被引量：3

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作者 佳莉娟 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期601-605,共5页

目的探讨重组嗜肺军团菌鞭毛蛋白A(rflaA)对RAW264.7巨噬细胞分泌白细胞介素6(IL-6)、IL-1β的影响及其机制。方法采用(0.000、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000)μg/mL rflaA处理RAW264.7细胞,并设细胞对照组,用CCK-8... 目的探讨重组嗜肺军团菌鞭毛蛋白A(rflaA)对RAW264.7巨噬细胞分泌白细胞介素6(IL-6)、IL-1β的影响及其机制。方法采用(0.000、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000)μg/mL rflaA处理RAW264.7细胞,并设细胞对照组,用CCK-8法确定rflaA的半数效应剂量(EC_(50))。采用(0.04、0.08、0.16)μg/mL rflaA处理RAW264.7细胞24、36、48 h,采用ELISA检测IL-6、IL-1β分泌水平;(0.04、0.08、0.16)μg/mL rflaA处理RAW264.7细胞6、12、24、36、48 h,收集细胞,实时定量PCR检测IL-6、IL-1β、NOD样受体蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(caspase-1)mRNA的含量;Western blot法检测NLRP3、caspase-1蛋白水平。结果 rflaA可促进RAW264.7细胞因子分泌,RAW264.7细胞被不同剂量的rflaA作用24、36、48 h,随rflaA剂量的递增,IL-6、IL-1β水平增加,以0.16μg/mL剂量时作用最显著,36 h达高峰;rflaA可增加RAW264.7细胞的IL-6、IL-1β、NLRP3、caspase-1 RNA水平,0.16μg/mL rflaA作用最显著,12 h达高峰;RAW264.7细胞被不同剂量的rflaA作用6、12、24、36 h,随rflaA剂量增加NLRP3、caspase-1表达水平增加,以0.16μg/mL剂量时作用最显著,24 h达高峰。结论 rflaA通过刺激NLRP3、caspase-1而增加RAW264.7细胞IL-6、IL-1β的分泌。 展开更多

关键词 嗜肺军团菌 重组嗜肺军团菌鞭毛蛋白(rflaA) 巨噬细胞 细胞因子

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上调小鼠骨髓来源树突状细胞FcγRⅡb表达可抑制其抗原提呈功能 被引量：2

19

作者 孙卉 马海峰 +1 位作者 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期664-667,671,共5页

目的构建FcγRⅡb慢病毒载体,感染小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC),观察BMDC抗原提呈功能变化。方法小鼠骨髓细胞中提取RNA,反转录后进行PCR扩增得到FcγRⅡb目的基因,将FcγRⅡb基因插入慢病毒表达载体TRE中构建FcγRⅡb重组慢病毒载体。... 目的构建FcγRⅡb慢病毒载体,感染小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC),观察BMDC抗原提呈功能变化。方法小鼠骨髓细胞中提取RNA,反转录后进行PCR扩增得到FcγRⅡb目的基因,将FcγRⅡb基因插入慢病毒表达载体TRE中构建FcγRⅡb重组慢病毒载体。HEK293T细胞包装慢病毒,体外进行小鼠BMDC的诱导培养及鉴定。将慢病毒感染BMDC后,实时定量PCR检测BMDC中FcγRⅡb mRNA水平,Western blot法检测BMDC中FcγRⅡb蛋白水平,流式细胞术分析BMDC表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的变化。结果成功构建FcγRⅡb重组慢病毒载体,经酶切、PCR鉴定及测序鉴定成功。体外诱导培养BMDC,可见细胞表面大量树枝样突起形成。包装慢病毒感染BMDC后,FcγRⅡb mRNA和蛋白水平均较未感染BMDC增高。流式细胞术分析感染后BMDC表面分子CD80、CD86、CD40、MHC II的表达量均较未感染BMDC下降。结论DC上FcγRⅡb的过表达能够下调其抗原提呈功能。 展开更多

关键词 FcγRⅡb 慢病毒 树突状细胞

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化疗可增加肺鳞状细胞癌患者外周血中FcγRⅡB含量 被引量：1

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作者 卢敬敬 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期220-224,共5页

目的检测肺鳞状细胞癌患者化疗前后外周血单核细胞和B细胞膜表面FcγRⅡB表达水平、血清中可溶性FcγRⅡB(s FcγRⅡB)及其抗体的含量。方法免疫荧光技术检测鳞状细胞癌患者化疗前后单核细胞和B细胞膜表面FcγRⅡB的表达和定位、实时定... 目的检测肺鳞状细胞癌患者化疗前后外周血单核细胞和B细胞膜表面FcγRⅡB表达水平、血清中可溶性FcγRⅡB(s FcγRⅡB)及其抗体的含量。方法免疫荧光技术检测鳞状细胞癌患者化疗前后单核细胞和B细胞膜表面FcγRⅡB的表达和定位、实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA水平,Western blot法检测s FcγRⅡB蛋白水平;ELISA检测鳞状细胞癌患者化疗前后、健康人血清中s FcγRⅡB总量、与Ig G结合的s FcγRⅡB(s FcγRⅡB-Ig G)、抗FcγRⅡB自身抗体的含量变化。结果与健康人相比,鳞状细胞癌患者化疗前单核细胞和B细胞FcγRⅡB的水平、s FcγRⅡB总量及抗FcγRⅡB自身抗体的含量明显降低,化疗后高于化疗前;s FcγRⅡB-Ig G含量高于健康人,化疗后低于化疗前。结论鳞状细胞癌患者FcγRⅡB含量减少,化疗后FcγRⅡB表达有所增加。 展开更多

关键词 鳞状细胞癌 FcγRⅡB B细胞 单核细胞

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