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大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)逆转录病毒周期蛋白(OrfA)相互作用蛋白的酵母双杂交筛选 被引量:5
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作者 徐坤 王亮亮 +3 位作者 张婷婷 周罡 张志强 张智英 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期267-275,共9页
大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤(WDS)在秋季发生春季萎缩的季节性生长特点与大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助基因的表达有关.其中辅助基因orfA的表达产物OrfA蛋白可能是1个潜在的肿瘤相关因子,OrfA与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D同源,也被称... 大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤(WDS)在秋季发生春季萎缩的季节性生长特点与大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助基因的表达有关.其中辅助基因orfA的表达产物OrfA蛋白可能是1个潜在的肿瘤相关因子,OrfA与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D同源,也被称为逆转录病毒周期蛋白(retroviral-cyclin).为了深入研究OrfA的作用和功能,我们构建了诱饵表达载体pGBKT7-orfA,采用酵母双杂交技术,从HeLa cDNA文库中筛选与其相互的蛋白因子.通过2轮高强度压力的筛选、β-半乳糖苷酶活性验证、回转验证以及测序分析,最终获得了1个与OrfA相互作用的转录因子E2F5.OrfA C端78个氨基酸的多肽或者缺失C端78个氨基酸的OrfA突变体均不能在酵母双杂交系统中与E2F5相互作用.这些发现为进一步研究OrfA在肿瘤萎缩中的功能奠定了基础. 展开更多
关键词 大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒 逆转录病毒周期蛋白(OrfA) 酵母双杂交 E2F5转录因子
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大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA与orfC重组腺病毒的制备及应用
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作者 张优优 徐坤 +5 位作者 王亮亮 张婷婷 辛颖 任充华 闫强 张智英 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2012年第12期34-40,共7页
【目的】扩增大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC,制备orfA和orfC重组腺病毒,并感染Hela229和SPC-A-1细胞,以检测orfA和orfC对肿瘤细胞的影响。【方法】从pWDSV全长表达载体中扩增WDSV辅助基因orfA和orfC,构建orfA和orfC... 【目的】扩增大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC,制备orfA和orfC重组腺病毒,并感染Hela229和SPC-A-1细胞,以检测orfA和orfC对肿瘤细胞的影响。【方法】从pWDSV全长表达载体中扩增WDSV辅助基因orfA和orfC,构建orfA和orfC基因的重组腺病毒载体以及对照空载体,采用脂质体介导法转染HEK293细胞进行包装和扩增,用绿色荧光蛋白法测定重组腺病毒的滴度;将重组腺病毒转染肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1,采用Weastern Blot方法检测基因orfA和orfC的表达情况,并用MTT法检测其对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的影响。【结果】PCR扩增获得了891bp的orfA基因和360bp的orfC基因,成功构建了对照空载体pAdEasy-l-CK和含有orfA和orfC基因的腺病毒载体pAdEasy-l-orfA和pAdEasy-l-orfC,转染HEK293细胞并进行包装后获得了重组腺病毒Ad-CK、Ad-orfA和Ad-orfC,用Hela229细胞测得其滴度分别为5.67×109,2.00×109和7.33×108 GFU/mL。重组腺病毒对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的生长具有抑制作用。【结论】初步证明了orfA和orfC基因对人类肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的生长具有抑制作用,为进一步研究WDSV辅助基因对人类肿瘤的影响以及肿瘤萎缩的分子机理奠定了基础。 展开更多
关键词 大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒 orfA基因 orfC基因 重组腺病毒 肿瘤
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大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC多抗的制备及初步应用 被引量:2
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作者 李铎 徐坤 +3 位作者 王亮亮 周罡 麻丽霞 张智英 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2012年第10期23-30,共8页
【目的】制备大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC的多克隆抗体,并用其检测酵母和肿瘤细胞中目的蛋白的表达。【方法】以WDSV基因组序列为模板,PCR扩增WDSVorfA和orfC基因,分别构建其原核表达载体,转化Rosseta(DE3)感受态细... 【目的】制备大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC的多克隆抗体,并用其检测酵母和肿瘤细胞中目的蛋白的表达。【方法】以WDSV基因组序列为模板,PCR扩增WDSVorfA和orfC基因,分别构建其原核表达载体,转化Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白后,采用皮下多点注射结合耳静脉加强免疫的方法免疫新西兰白兔,制备抗orfA和抗orfC的多克隆抗体,用Western blot法检测抗体的特异性。用制备的多克隆抗体检测orfA和orfC融合蛋白在酵母和HeLa299、SPC-A-1肿瘤细胞中的表达。【结果】PCR扩增获得了WDSVorfA和orfC基因。成功构建了orfA和orfC基因的原核表达载体并进行了诱导表达,orfA和orfC重组融合蛋白以包涵体形式存在;采用皮下注射结合耳静脉加强免疫有效地提高了抗体效价,成功制备得到了兔抗orfA和兔抗orfC血清,抗体效价达1∶8 000~1∶10 000;通过Western blot法,利用上述抗血清分别检测到了原核表达的目的蛋白及酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白。【结论】制备得到的抗orfA和抗orfC多克隆抗体具有很好的特异性,能够用于原核表达、酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白的Western blot检测。 展开更多
关键词 大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒 orfA基因 orfC基因 原核表达 多克隆抗体
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