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猪细小病毒NS1蛋白单链抗体库的构建及筛选
1
作者 张丽萌 李闰婷 +6 位作者 宋月 聂晓宁 孔莉 单靖微 许盈盈 王林青 陈龙欣 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第7期3276-3285,共10页
【目的】筛选特异性抗猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)非结构蛋白NS1的单链抗体(scFv),为后续研究PPV奠定基础。【方法】通过原核表达系统诱导表达并纯化PPV NS1蛋白,利用重组NS1蛋白进行动物免疫,检测血清效价水平后,采集小鼠脾脏... 【目的】筛选特异性抗猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)非结构蛋白NS1的单链抗体(scFv),为后续研究PPV奠定基础。【方法】通过原核表达系统诱导表达并纯化PPV NS1蛋白,利用重组NS1蛋白进行动物免疫,检测血清效价水平后,采集小鼠脾脏提取总RNA并逆转录成cDNA,以其为模板扩增抗体重链可变区(variable domain of heavy chains,VH)和轻链可变区(variable domain of light chains,VL)序列;通过重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,将其与酶切的pSEXRTL2噬菌体载体连接并电转化大肠杆菌XLⅠ-Blue感受态细胞,构建鼠源性抗PPV NS1的scFv抗体文库,并测定文库质量及库容量;利用噬菌体展示技术筛选对NS1蛋白具有特异性的scFv,通过ELISA和Western blotting检测抗原与阳性噬菌体克隆的亲和力。【结果】本试验成功表达纯化获得可溶性PPV NS1重组蛋白;构建的鼠源抗NS1 scFv文库的库容量为2.7×10^(7) CFU/mL,文库阳性率为87.5%;通过4轮“吸附-洗脱-富集”噬菌体筛选,最终获得2株与PPV NS1蛋白特异性结合的亲和力较高的scFv。【结论】本研究通过原核表达纯化重组蛋白NS1,成功构建鼠源抗PPV NS1蛋白的scFv噬菌体文库,利用噬菌体展示技术筛选获得了可与NS1重组蛋白特异性结合的scFv。试验结果为进一步研发抗PPV药物及诊断试剂提供依据。 展开更多
关键词 猪细小病毒(PPV) 单链抗体(scfv) NS1蛋白 噬菌体文库
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人源性抗SARS-CoV-2单链抗体文库的构建及广谱中和抗体的筛选与鉴定
2
作者 尹慧敏 吕海 +3 位作者 迟莹 刘静娴 焦永军 卫平民 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第2期154-160,共7页
目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA... 目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA,逆转录成cDNA,以此为模板构建人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库;利用噬菌体展示技术筛选对SARS-CoV-2 S蛋白具有特异性的scFv抗体。通过序列分析和人源IgG抗体表达,合成IgG全抗体,并评估其对SARS-CoV-2的结合能力及中和活性。结果成功构建了库容量为1.56×10^(7)CFU的SARS-CoV-2人源性scFv抗体文库,筛选出两种特异性scFv抗体;并将scFv抗体表达成IgG形式的全抗体(IgG-A10和IgG-G6),其中IgG-A10对SARS-CoV-2原始株(WT)和奥密克戎亚型变异毒株XBB(XBB)毒株均具有较好中和活性,对奥密克戎BA.2.86变异株的第二代亚分支JN.1(JN.1)毒株中和效果一般。结论本研究从康复者外周血中成功构建了人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库,并筛选表达出具有中和活性的抗SARS-CoV-2 IgG抗体,为SARS-CoV-2感染的预防、诊断和治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 SARS-CoV-2 单链可变片段(scfv) 噬菌体展示技术 中和抗体
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肿瘤血管特异结合抗体ScFvH1的靶向性和抑瘤性 被引量：1
3
作者 秦玺 马航航 +1 位作者 薛建红 胡宝成 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第2期120-125,共6页
目的:检测从肿瘤特异单链抗体库中筛选到的肿瘤血管特异结合单链抗体ScFvH1的靶向性和抑瘤性,探讨该抗体在癌症诊断和治疗中应用的可能性。方法:将该单链抗体基因插入到含绿色荧光蛋白(EGFP)基因及带有硫氧还原蛋白(Trx)基因的原核表达... 目的:检测从肿瘤特异单链抗体库中筛选到的肿瘤血管特异结合单链抗体ScFvH1的靶向性和抑瘤性,探讨该抗体在癌症诊断和治疗中应用的可能性。方法:将该单链抗体基因插入到含绿色荧光蛋白(EGFP)基因及带有硫氧还原蛋白(Trx)基因的原核表达载体pET-28a(+)/EGFP及pTIG-Trx中,在大肠杆菌中进行表达,并经镍柱(Ni-NTA)纯化。建立人宫颈癌HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤模型,尾静脉注射纯化的单链抗体-EGFP融合蛋白,通过荧光显微镜观察肿瘤部位及其他器官中EGFP信号,考察该单链抗体的靶向性;同时在裸鼠致瘤部位注射纯化的单链抗体蛋白,观察该单链抗体对肿瘤生长的抑制性。结果:在大肠杆菌中表达了该单链抗体基因片段,并使单链抗体-EGFP融合蛋白得到了很好的表达,经镍柱纯化后得到了电泳级的单一条带。靶向性实验结果显示,单链抗体-EGFP融合蛋白在肿瘤部位得到了富集,而只注射EGFP蛋白的肿瘤组织中荧光很少,并且在裸鼠肺部组织中没有观察到EGFP荧光信号。抑瘤性实验发现,单链抗体处理组移植瘤生长速率与PBS组类似。结论:从肿瘤特异单链抗体库中筛选到的肿瘤血管特异抗体ScFvH1具有较好的肿瘤血管靶向性,而对肿瘤生长的抑制作用不明显,为进一步研究抗体在肿瘤诊断和治疗中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 肿瘤血管 单链抗体 靶向性 抑瘤性
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一种可溶性单抗ScFv片段的表达及鉴定 被引量：1
4
作者 钟小林 高会广 +1 位作者 吉清 黄刚 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第8期691-694,共4页
目的　利用E .coliHB2 15 1表达结肠癌单抗MC3的单链可变区片段 (Singlechainvariablefragment,ScFv) ,纯化并鉴定其抗原结合活性 ,为结肠癌体内诊断和治疗性研究提供靶向载体分子。方法　利用呈现ScFv抗体的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2 ... 目的　利用E .coliHB2 15 1表达结肠癌单抗MC3的单链可变区片段 (Singlechainvariablefragment,ScFv) ,纯化并鉴定其抗原结合活性 ,为结肠癌体内诊断和治疗性研究提供靶向载体分子。方法　利用呈现ScFv抗体的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2 15 1进行可溶性抗体表达 ,经点印迹和Western印迹检测可溶性单抗ScFv的表达水平 ,经ELISA检测可溶性ScFv的抗原结合活性。用双脱氧法对组成ScFvDNA的VH和VLDNA进行序列测定。结果　可溶性MC3ScFv获得了成功表达 ,表达产物主要位于周质腔中 ,其分子量约为 3 2× 10 3。来自所获得的 3个克隆周质提取物均能抑制单抗与高水平表达MC3结合抗原的AGS细胞结合 ,抑制率分别为 41.19%、3 6.89%、3 3 .77%。对ScFv的VH和VLDNA的测序结果表明所获抗体的可变区基因属IgG1亚族 ,κ型。结论　利用大肠杆菌HB2 15 1成功表达了具有抗原结合活性的MC3ScFv ,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。 展开更多
关键词 结肠癌 单克隆抗体 单链可变区片段 噬菌体
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抗TfR scFv-SLC融合蛋白的构建、表达与鉴定
5
作者 潘兴飞 刘静 +7 位作者 沈昕 许海霞 姚欣欣 陈广生 胡军 朱慧芬 雷萍 沈关心 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期832-834,843,共4页
目的:构建、表达和鉴定抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体(scFv)-次级淋巴组织趋化因子(SLC)融合蛋白。方法:以pDsRed2-N1-CCL21为模板,设计引物,采用PCR扩增得到两端有EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点的SLC基因。以EcoRⅠ、NotⅠ双酶切pET28a+scFv载... 目的:构建、表达和鉴定抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体(scFv)-次级淋巴组织趋化因子(SLC)融合蛋白。方法:以pDsRed2-N1-CCL21为模板,设计引物,采用PCR扩增得到两端有EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点的SLC基因。以EcoRⅠ、NotⅠ双酶切pET28a+scFv载体和PCR产物,连接后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TfRscFv-SLC融合蛋白的表达。SDS-PAGE、Western blot分析TfR scFv-SLC的表达特性。FCM测定scFv-SLC与肿瘤细胞结合活性。结果:EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定可见约350bp的小片段,与SLC的理论值相符,DNA测序结果表明含有TfRscFv-Linker-SLC序列,表明pET28a+scFv-SLC融合基因表达载体构建成功。IPTG诱导产物经SDS-PAGE分析可见约41kD的条带,符合scFv-SLC理论值。FCM结果显示TfR scFv-SLC可与MCF-7、HepG2细胞结合,且结合的阳性率较TfRscFv有所提高。结论:成功构建与表达scFv-SLC融合蛋白,且能与MCF7、HepG2等细胞特异性结合。 展开更多
关键词 转铁蛋白受体 单链抗体 次级淋巴组织趋化因子 融合蛋白
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抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析
6
作者 刘兵 史俊岩 +5 位作者 王舰 王美莲 王斯 郑兰艳 牟玲 罗恩杰 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2009年第2期29-32,共4页
诱导已构建的重组质粒pGEX-6P-1-scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS-PAGE电泳检... 诱导已构建的重组质粒pGEX-6P-1-scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS-PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS-PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。 展开更多
关键词 汉坦病毒 scfv 表达
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抗对硫磷基因工程抗体ScFv的制备及其初步鉴定 被引量：2
7
作者 宋丽敏 张维 +1 位作者 林敏 潘家荣 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期856-859,共4页
用一段45个核苷酸的片段连接抗对硫磷抗体重链和轻链可变区基因片段VH和VL,获得了抗对硫磷单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因,构建了抗对硫磷scFv基因原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot分析显示,该单链抗体基因能... 用一段45个核苷酸的片段连接抗对硫磷抗体重链和轻链可变区基因片段VH和VL,获得了抗对硫磷单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因,构建了抗对硫磷scFv基因原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot分析显示,该单链抗体基因能在大肠杆菌Origami 2中特异性表达,融合蛋白分子量约为28kD。用Ni-NTA金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化,得到目的蛋白纯度为74.8%;ELISA反应结果证明,该单链抗体可以与对硫磷发生特异性反应。 展开更多
关键词 对硫磷 单链抗体 原核表达
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H_3N_2亚型犬流感病毒鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的制备与活性分析 被引量：4
8
作者 赵丹 邱冬 +1 位作者 韩德敏 刘永杰 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期474-481,共8页
[目的]为减少鼠源单克隆抗体的异源性在犬临床治疗中引起的宿主免疫排斥反应,针对H_3N_2亚型犬流感病毒(CIV),制备具有犬源抗体恒定区基因(Fc)的鼠/犬嵌合抗体。[方法]从产生具有良好中和活性CIV单抗的鼠源杂交瘤细胞株中扩增抗体重链... [目的]为减少鼠源单克隆抗体的异源性在犬临床治疗中引起的宿主免疫排斥反应,针对H_3N_2亚型犬流感病毒(CIV),制备具有犬源抗体恒定区基因(Fc)的鼠/犬嵌合抗体。[方法]从产生具有良好中和活性CIV单抗的鼠源杂交瘤细胞株中扩增抗体重链和轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得单链抗体基因(scFv)片段,同时从犬外周血单核细胞中扩增得到犬源抗体Fc片段;分别构建单链抗体与嵌合抗体表达载体,通过大肠杆菌表达、纯化后调整蛋白浓度为1 mg·mL^(-1),检测单链抗体与嵌合抗体的ELISA和血凝抑制(HI)效价,并分析其对病毒感染细胞的中和活性。[结果]获得的H_3N_2亚型CIV鼠源scFv的相对分子质量为45×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶640(1.56μg·mL^(-1))和1∶160(6.25μg·mL^(-1)),中和效价为1∶160(6.25μg·mL^(-1));鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的相对分子质量为80×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶2 560(0.39μg·mL^(-1))和1∶640(1.56μg·mL^(-1)),中和效价为1∶40(25μg·mL^(-1))。[结论]成功制备了H_3N_2亚型CIV鼠/犬嵌合抗体,为犬流感的临床治疗提供了物质基础。 展开更多
关键词 H3N2亚型 犬流感病毒 单链抗体 嵌合抗体 犬源化
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力场/溶剂水模型对EGFRvⅢ抗原-MR1(scFv)抗体复合物的MM-PBSA计算精度的影响与实验验证
9
作者 任家毅 杨志伟 +8 位作者 郑念珏 李军旗 杨春龙 林淑健 杨冰 黄俊卿 廖化新 袁晓辉 欧仕益 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2017年第11期2070-2076,共7页
以表皮生长因子Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)抗原多肽与其抗体(MR1)及其人源化突变体的复合物结构为出发点,采用分子动力学中的6种常用力场及3种常用溶剂水模型,分别对上述抗原-抗体复合物进行100ns的分子动力学模拟与分子力学和连续介质模型计... 以表皮生长因子Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)抗原多肽与其抗体(MR1)及其人源化突变体的复合物结构为出发点,采用分子动力学中的6种常用力场及3种常用溶剂水模型,分别对上述抗原-抗体复合物进行100ns的分子动力学模拟与分子力学和连续介质模型计算自由能(MM-PBSA),并在实验上利用等温滴定量热(ITC)仪测定了抗原和抗体相互作用的热力学参数.通过在结构变化、能量变化及野生型与突变体比较等几个方面进行综合分析,给出了最佳的计算模型.对不同力场及水模型计算精度等相关问题进行了探讨. 展开更多
关键词 单链抗体 分子动力学模拟 分子力学和连续介质模型的自由能计算 等温滴定量热 均方根偏差
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scFv亲和力对CAR-T细胞抗肿瘤能力的影响 被引量：2
10
作者 张代群 李峰 +3 位作者 王淑敏 张凯 石晓娟 张毅 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1044-1048,1057,共6页
目的:比较抗原亲和力不同的scFv片段对CAR-T细胞增殖、分化和抗肿瘤能力的影响。方法:分别构建靶向ErbB2的FRP5(K_D=30 nmol/L)和chA21(K_D=11 nmol/L)CAR慢病毒表达载体,包装病毒后制备CD8^+CAR-T细胞;在CAR-T细胞扩增过程中,通过计数... 目的:比较抗原亲和力不同的scFv片段对CAR-T细胞增殖、分化和抗肿瘤能力的影响。方法:分别构建靶向ErbB2的FRP5(K_D=30 nmol/L)和chA21(K_D=11 nmol/L)CAR慢病毒表达载体,包装病毒后制备CD8^+CAR-T细胞;在CAR-T细胞扩增过程中,通过计数细胞来检测细胞增殖;利用流式细胞术检测CAR-T细胞分化情况;利用荧光素酶活性法检测杀伤活性;用ELISA检测CAR-T细胞在肿瘤识别过程中IL-2和IFN-γ的分泌情况;利用成像流式细胞仪检测scFv亲和力对CAR-T细胞形成免疫突触能力的影响。结果:成功构建了CD8^+ CAR-T细胞,FRP5和chA21 CAR阳性率均达50%左右;CAR-T细胞的增殖和分化状态没有差异;荧光素酶活性法显示chA21-CAR-T细胞裂解肿瘤细胞的能力较强;ELISA检测结果显示chA21-CAR-T细胞分泌细胞因子能力更强;chA21-CAR-T细胞形成免疫突触的能力更强。结论:包含高亲和力scFv的chA21-CAR-T细胞具有较强的抗原依赖性杀伤活性。 展开更多
关键词 单链可变区(scfv) ERBB2 亲和力 嵌合抗原受体T细胞 细胞杀伤
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应用噬菌体展示随机12肽库筛选诺如病毒抗原模拟表位
11
作者 周飞园 王璐 +6 位作者 梁芷妍 林璧慧 李佳恒 王宇 井多娜 张绪富 戴迎春 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期383-388,共6页
目的:利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选诺如病毒(NoV)的抗原模拟表位。方法:包被与GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17型NoV具有高特异性及中和能力较强的单链可变片段抗体(scFv),用Ph.D.-12噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选。ELISA鉴定淘选所得噬菌体与... 目的:利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选诺如病毒(NoV)的抗原模拟表位。方法:包被与GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17型NoV具有高特异性及中和能力较强的单链可变片段抗体(scFv),用Ph.D.-12噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选。ELISA鉴定淘选所得噬菌体与scFv的结合活性及其与NoV P蛋白的竞争作用;阳性克隆测序后进行生物信息学分析,合成多肽鉴定其抗原性。结果:发现1段与GⅡ.6 VP1区同源性较高的氨基酸序列“MG-D-W”,综合分析提示其可能为GⅡ.6 NoV的抗原模拟表位,且合成的包含“MG-D-W”的多肽可竞争抑制P蛋白与人类组织血型抗原(HBGAs)受体的结合。结论:“MG-DW”是与NoV单链抗体高亲和力的肽段,可能模拟了GⅡ.6 NoV与scFv结合的抗原表位。 展开更多
关键词 诺如病毒 12肽库 抗原模拟表位 单链可变片段抗体
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人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定 被引量：5
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作者 徐重新 张存政 +3 位作者 张霄 刘媛 黄鹰 刘贤金 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期47-52,共6页
利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立... 利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对E.coli HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μg.mL-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μg.mL-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μg.mL-1,线性检测范围为0.5～5.0μg.mL-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在E.coliHB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在E.coli HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。 展开更多
关键词 Cry1B毒素蛋白 单链抗体 可溶性表达 抗原结合活性
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^(131)I标记CD133单链抗体对人肝癌CD133^+ HepG2干细胞的抑制作用 被引量：6
13
作者 侯妍利 陈兴月 +4 位作者 段丽群 唐敏 康强强 舒锦 李少林 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期7-13,共7页
目的:研究131I标记CD133单链抗体(single chain rariable fragment,ScFv)在体外对人肝癌CD133+HepG2干细胞的抑制作用。方法:免疫磁珠分选HepG2细胞,流式细胞术检测分选前后HepG2细胞的CD133表达率,克隆形成实验及体内成瘤实验验证CD133... 目的:研究131I标记CD133单链抗体(single chain rariable fragment,ScFv)在体外对人肝癌CD133+HepG2干细胞的抑制作用。方法:免疫磁珠分选HepG2细胞,流式细胞术检测分选前后HepG2细胞的CD133表达率,克隆形成实验及体内成瘤实验验证CD133+HepG2细胞的"干性"。氯胺T法131I标记CD133 ScFv并测定标记率、比活度、放射性浓度。将分选出的CD133+HepG2细胞分为131I-CD133抗体治疗组、131I治疗组、CD133抗体治疗组和131I+CD133抗体治疗组,MTT法检测各组中对CD133+HepG2细胞生长抑制的最适剂量和不同药物在12、48、72 h三个时间点对CD133+HepG2干细胞的生长抑制作用,流式细胞术检测各组细胞周期的变化。结果:分选的HepG2细胞的CD133表达率显著高于未分选细胞[(97.71±1.13)%vs(1.52±0.78)%,t=1.13、P=0.000]。CD133+HepG2细胞相对于CD133-HepG2细胞具有更强的体外成球、克隆形成能力[(45.03±1.35)%vs(7.4±0.54)%;t=3.92,P=0.000]和体内成瘤能力。131I-CD133 ScFv的标记率为88.92%,放射化学纯度为98.63%。当131I为3.7 MBq/100μl、CD133抗体为1μg/100μl时,对CD133+HepG2细胞的抑制率最高,达(89.58±0.74)%;在此剂量下131I-CD133 ScFv治疗组对CD133+HepG2细胞生长抑制率显著高于其余各实验组,且呈时间依赖性。131I-CD133 ScFv治疗组G0/G1期细胞比例为(27.50±1.12)%,较其余各组均明显减少(P<0.05)。结论:成功制备的131I-CD133 ScFv在体外能有效抑制人肝癌CD133+HepG2干细胞的生长。 展开更多
关键词 肝癌干细胞 CD133 ^131I 单克隆抗体 单链抗体
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抗猪瘟病毒单链抗体基因的构建及其推导的蛋白质三级结构的分子模拟 被引量：6
14
作者 刘金凤 吴健敏 +3 位作者 覃绍敏 白安斌 陈凤莲 曹颖颖 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第4期817-823,共7页
为利用抗猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)单链抗体基因(ScFv)建立CSFV病原快速检测方法,以抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA为模板,通过RT-PCR扩增重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),以柔性多肽(Gly4Ser)3为接... 为利用抗猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)单链抗体基因(ScFv)建立CSFV病原快速检测方法,以抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA为模板,通过RT-PCR扩增重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),以柔性多肽(Gly4Ser)3为接头(Linker),经重叠延伸反应将VH、VL基因拼接为完整的CSFV-ScFv基因,并进行克隆、测序分析。结果显示,所克隆单链抗体基因全长732 bp,包括363 bp的VH、45 bp的Linker和324 bp的VL,为VH-Linker-VL结构,编码的氨基酸序列含有明确的互补决定区(CDR)和框架区(FR)以及特征性的半胱氨酸残基,并与多种鼠源单链抗体基因高度同源,具有重组功能性鼠源抗体可变区特征。对CSFV-ScFv基因所编码蛋白质三级结构进行预测,显示其形成口袋样形状的空间构象,理论上具有良好的抗原结合活性。表明本研究成功构建了CSFV-ScFv基因。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 单链抗体 序列分析 分子模拟
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抗对虾白斑综合症病毒的单链抗体A1的表达和生物化学特性 被引量：7
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作者 张晓华 戴玲芬 戴和平 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期141-145,共5页
用噬菌体展示技术制备了抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)的单链抗体A1。该抗体在30℃培养条件下诱导表达20h后,其蛋白表达量可达总菌体蛋白的3.67%。用亲和层析柱和SephadexG-100层析柱可将单链抗体A1纯化为一条单电泳条带,其分子量约为31.... 用噬菌体展示技术制备了抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)的单链抗体A1。该抗体在30℃培养条件下诱导表达20h后,其蛋白表达量可达总菌体蛋白的3.67%。用亲和层析柱和SephadexG-100层析柱可将单链抗体A1纯化为一条单电泳条带,其分子量约为31.5kD。用等电聚焦电泳测定,其等电点为pH5.8。ELISA测定表明冻干的单链抗体A1在室温储藏4年后与WSSV结合仍具有较高的活力。 展开更多
关键词 单链抗体 白斑综合症病毒(WSSV) 对虾
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抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析 被引量：4
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作者 李昌 金宁一 +4 位作者 王宏伟 刘玉生 于芳 佟敬山 胡宁宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1144-1146,共3页
目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应... 目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点,构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。BglⅡ线性化后,电转化入受体酵母菌GS115中,筛选阳性重组子,进行甲醇诱导表达,并用RT-PCR、SDS-PAGE、双抗体夹心Dot-ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果:通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌,RT-PCR、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达,表达量可占培养液上清总蛋白量的18%,双抗体夹心Dot-ELISA法检测,表达产物能够特异识别重组HIV-1gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应,证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论:成功地实现了scFv基因的分泌性表达,为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。 展开更多
关键词 HIV-1 外膜蛋白 单链抗体 酵母分泌表达
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抗转铁蛋白受体双价抗体的构建、表达及鉴定 被引量：2
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作者 肖代雯 朱慧芬 +6 位作者 沈昕 邢薇 黄宇 雷萍 黄韬 王国斌 沈关心 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期59-61,共3页
目的:抗转铁蛋白受体(TfR)双价抗体(bsFv)构建、表达及其与细胞结合的活性鉴定。方法:以抗TfR的单链抗体(scFv)为模板,设计引物引入中间连接肽(G4S)及酶切位点AscI,通过PCR方法扩增两条scFv片段,将其连接并克隆至原核表达载体pAB1,转化... 目的:抗转铁蛋白受体(TfR)双价抗体(bsFv)构建、表达及其与细胞结合的活性鉴定。方法:以抗TfR的单链抗体(scFv)为模板,设计引物引入中间连接肽(G4S)及酶切位点AscI,通过PCR方法扩增两条scFv片段,将其连接并克隆至原核表达载体pAB1,转化大肠杆菌TG1,阳性菌经IPTG诱导表达,FCM检测bsFv与K562,HepG2肿瘤细胞结合的活性及特异性。结果:酶切鉴定及DNA测序证明该bsFv构建成功;SDS-PAGE、Western blot鉴定表明表达蛋白分子量与bsFv理论值一致;FCM结果证明bsFv可与K562,HepG2肿瘤细胞特异性结合,且结合的阳性率较scFv有所提高。结论:成功构建了抗转TfR的bsFv,且能与K562,HepG2肿瘤细胞特异性结合。 展开更多
关键词 转铁蛋白受体 单链抗体 双价抗体
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具有GPX活性单链抗体的制备及其抗氧化效应 被引量：4
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作者 李维佳 魏景艳 +4 位作者 孙晔 牟颖 吕绍武 闫岗林 罗贵民 《吉林大学学报（理学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期458-462,共5页
为实现单链抗体的可溶性表达,制备具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力的单链抗体,在单链抗体表达载体pTMF 2F3上去除原2F3基因N端非必需的18个氨基酸,采用新的表达载体pRose质粒,在2F3的N端引入13个氨基酸的前导肽,转入BL21(lysS)中,使其... 为实现单链抗体的可溶性表达,制备具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力的单链抗体,在单链抗体表达载体pTMF 2F3上去除原2F3基因N端非必需的18个氨基酸,采用新的表达载体pRose质粒,在2F3的N端引入13个氨基酸的前导肽,转入BL21(lysS)中,使其分泌到大肠杆菌的周质腔中得以表达,获得可溶性表达产物.产物经过分离纯化、WesternBlot印迹和硒化测活确定具有GPX活性的鼠单链抗体,其GPX活力为2530U/μmol.以脂质过氧化、细胞存活率和细胞膜完整性为指标的抗氧化实验研究表明,具有GPX活性的单链抗体对大鼠乳鼠表皮细胞有抗紫外线损伤的作用,是膜脂质过氧化的有效抑制剂. 展开更多
关键词 谷胱甘肽过氧化物酶 单链抗体 可溶性表达 抗氧化
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量子点与人源抗谷胱甘肽单链抗体的连接与表征 被引量：2
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作者 徐俊杰 王诗雯 +7 位作者 赵虹 陈桂秋 霍锐 田莉 段玉晶 李敏杰 杨柏 魏景艳 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2009年第3期506-509,共4页
用已构建的表达载体pPELB-B3,在大肠杆菌Rosetta中可溶性表达人源抗谷胱甘肽(GSH)单链抗体B3(scFv-B3),经N i2+螯合亲和层析纯化后,用点印迹法验证了其与GSH结合的特异性.将水相合成的半导体纳米粒子(半导体量子点,QD s)在N-羟基琥珀酰... 用已构建的表达载体pPELB-B3,在大肠杆菌Rosetta中可溶性表达人源抗谷胱甘肽(GSH)单链抗体B3(scFv-B3),经N i2+螯合亲和层析纯化后,用点印迹法验证了其与GSH结合的特异性.将水相合成的半导体纳米粒子(半导体量子点,QD s)在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下,与scFvs连接.光谱分析和膜印迹结果表明,scFvs成功地共价连接到QD s表面,所得的QD-scFvs复合物能够较好地识别GSH.荧光显微镜观察QD-scFvs与人乳腺癌细胞MCF-7的作用结果,初步判断QD-scFvs能够跨膜进入细胞. 展开更多
关键词 量子点 人源单链抗体 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) 共价结合 印迹
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抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究 被引量：4
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作者 胡祖权 李和平 +2 位作者 吴平 廖玉才 张静柏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期238-243,共6页
通过优化诱导表达条件,实现抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌周质中高效可溶性表达。将抗镰刀菌单链抗体FvSG7转化到大肠杆菌XL1-Blue中,确定诱导表达培养基,在不同的诱导温度、诱导剂IPTG的浓度和诱导时间条件下培养重组大肠杆菌,通过Wester... 通过优化诱导表达条件,实现抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌周质中高效可溶性表达。将抗镰刀菌单链抗体FvSG7转化到大肠杆菌XL1-Blue中,确定诱导表达培养基,在不同的诱导温度、诱导剂IPTG的浓度和诱导时间条件下培养重组大肠杆菌,通过Western杂交和ELISA检测分析单链抗体的可溶性表达情况以及抗体的活性。重组大肠杆菌培养至OD600nm为0.5时加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG,25℃诱导表达2 h可获得最大量的可溶性单链抗体。通过对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化,可以显著提高Fv SG7抗体在大肠杆菌XL1-Blue周质中的表达量。 展开更多
关键词 单链抗体 可溶性表达 大肠杆菌 优化
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